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目的:观察5-烯丙基-7-二氟甲氧基白杨素(AFMC)与肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)合用对人肺腺癌A549细胞凋亡的影响。并探讨其机制是否涉及死亡受体5(DR5)的上调。
方法:体外培养人肺腺癌A549细胞和永生化二倍体人胚肺WI-38细胞。全自动生化分析仪测定细胞培养液中乳酸脱氢酶(LDH)活性。流式细胞术(FCM)定量分析细胞凋亡率。DNA琼脂糖凝胶电泳观察细胞DNA核小体间断裂。Western Bloting检测细胞DR5蛋白的表达。
结果:通过测定细胞培养液LDH活性的细胞毒性实验结果显示,AFMC、TRAIL对A549细胞毒性的半数有效浓度(EC50值)分别为13μmol/L、1850 ng/mL,1.0μmol/L AFMC预孵育30 min,再加入TRAIL处理24 h,EC50值为36 ng/mL,合并用药效应指数(CI)值为0.076。白杨素(5,7-二羟基黄酮,ChR)对A549细胞毒性EC50为266μmol/L,10μmol/LChR与TRAIL合用的EC50值为45 ng/mL,CI值为0.004。单用亚毒性浓度的AFMC(1.0μmol/L)、TRAIL(30 ng/mL)或者两者合用对WI-38细胞毒性分别为(7.21±1.38)％、(6.52±1.25)％、(6.66±1.29)％,与溶媒组(0.2％ DMSO,(5.34±1.13)％)比较,差异无统计学意义。流式细胞术分析结果发现:AFMC((1.0μmol/L))、TRAIL((30 ng/mL))以及两者合用24h,A549细胞凋亡率即亚二倍体DNA含量细胞(sub-G1)百分率分别为(2.53±0.35)％、(2.69±0.52)％、(37.80±1.78)％。其中AFMC((1.0μmol/L))和TRAIL((30 ng/mL))联用24h,A549细胞sub-G1百分率在作用12 h后开始增加,24 h达高峰。DR5特异性阻断剂DR5/Fc嵌合蛋白(1μg/mL)能使亚毒性浓度的AFMC与TRAIL合用的A549细胞凋亡率从(37.80±1.78)％下降到(7.61±0.32)％；而AFMC((1.0μmol/L))、TRAIL((30 ng/mL))以及两者合用24 h处理WI-38细胞凋亡率分别为(0.31±0.08)％、(0.29±0.05)％、(0.35±0.12)％。与溶媒组(0.2％DMSO,(0.31±0.05)％)比较,差异无统计学意义。DNA琼脂糖凝胶电泳显示:AFMC(1.0μmol/L)联合TRAIL(30 ng/mL)处理A549细胞24 h,展示出典型DNA梯形条带图谱。Western Blot分析的结果发现:AFMC呈浓度和时间依赖性上调A549细胞DR5表达水平,DR5/Fc嵌合蛋白能有效阻断AFMC对DR5表达的上调效应。而AFMC对WI-38细胞DR5表达无明显影响。
结论:
1.亚细胞毒性浓度的AFMC具有选择性增强TRAIL对A549细胞毒性作用,其作用强于先导化合物ChR。
2.亚细胞毒性浓度的AFMC具有选择性增强TRAIL诱导A549细胞凋亡作用。
3.AFMC敏化TRAIL诱导A549细胞凋亡作用机制与其上调DR5表达有关。