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神经胶质瘤(Glioma)是最常见的中枢神经系统原发性肿瘤,约占中枢神经系统原发性肿瘤的50%。胶质瘤呈浸润性生长,恶性程度高,患者预后差,是引起中枢神经系统肿瘤相关性死亡的首要原因。近年来,胶质瘤治疗在手术方式、放疗、化疗、免疫治疗以及基因治疗等方面有了很大进展,但是胶质瘤仍然不能被治愈,患者中位生存期不超过1年。胶质瘤之所以不能被治愈,主要是因其具有高增殖力和强迁移侵袭性。因此,控制肿瘤细胞的增殖和迁移侵袭是治疗胶质瘤的首要目标。然而,现存的治疗手段受到药物神经毒性、血液毒性以及难以透过血脑屏障(Brain blood barrier, BBB)等诸多限制,对胶质瘤的治疗效果并不理想。因此,亟需开发新的有效且低毒并容易穿过血脑屏障的治疗手段,并且新的治疗手段需要对胶质瘤细胞增殖和迁移侵袭的分子机制进行深入的研究。粒细胞集落刺激因子(Granulocyte colony-stimulating factor, G-CSF)和褪黑素是临床常用的两种药物,均具有神经保护作用,且能透过血脑屏障。G-CSF且有促进骨髓造血的作用,临床上常用于骨髓抑制造成的粒细胞减少症,已经成为肿瘤治疗中重要的辅助治疗手段,但其对肿瘤细胞的作用,尚需进一步探讨。有研究报道褪黑素具有抗肿瘤的作用,有望成为胶质瘤的辅助治疗手段。G-CSF是生长因子家族成员,通过与其特异性受体G-CSF受体(G-CSFR)结合发挥作用,主要功能是刺激骨髓产生粒细胞和干细胞。除了造血系统,G-CSF还可以作用于神经系统,尤其在脑缺血等疾病状态下,G-CSFR在神经元中表达,被G-CSF激活后能够阻止神经元凋亡。G-CSF也可以促进神经干细胞(Neural stem cells, NSCs)的增殖和分化。这些现象都说明G-CSF在神经源性细胞的生长和维持方面发挥着重要作用。最近的研究发现,G-CSF与G-CSFR与肿瘤的发生和发展密切相关。造血干细胞中G-CSF信号通路持续过度激活可导致血液系统肿瘤的发生。同时研究也发现G-CSF与G-CSFR在多种肿瘤中表达,如黑色素瘤、肺小细胞癌、膀胱癌、前列腺癌及脑肿瘤等,并能促进肿瘤细胞的增殖与侵袭。但是目前G-CSF在人脑胶质瘤中的作用与作用机制尚不清楚。褪黑素(Melatonin)是由松果体(Pineal)、视交叉上核(Suprachiasmatic nucleus)及周围组织合成分泌的一种神经内分泌激素,具有抗氧化作用,在神经退行性疾病,如阿尔兹海默病(Alzheimer’s disease, AD)和帕金森氏病(Parkinson’s disease, PD)及脑缺血性疾病中保护神经元免受自由基损伤。研究发现褪黑素还具有抗肿瘤作用,能够抑制包括前列腺癌、结直肠癌、肝癌,黑色素瘤、卵巢癌及乳腺癌在内的多种肿瘤生长。最近有研究发现,在人乳腺癌细胞株MCF-7中,褪黑素通过提高E钙粘蛋白和β1整合素水平、调节微丝的排列及降低基质金属蛋白酶(MMPs)的产生抑制肿瘤细胞侵袭。有研究报道一定浓度的褪黑素能够阻止胶质瘤细胞从G1期进入S期从而抑制细胞增殖。但是,褪黑素对胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭的影响及机制仍不明确。本课题包含两部分,分别研究G-CSF及褪黑素对胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭的影响,并探讨其机制,以期为胶质瘤的治疗提供理论基础和实验依据。一、G-CSF对胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭的影响及机制研究1. G-CSF和G-CSFR在胶质瘤中的表达及与胶质瘤恶性程度的关系为了检测G-CSF和G-CSFR在胶质瘤中的表达,我们收集了29例人脑胶质瘤标本,所有标本均依据2007年世界卫生组织(World Health Organization, WHO)中枢神经系统肿瘤分类标准进行病理诊断并分级。其中WHO Ⅰ/Ⅱ级胶质瘤8例,Ⅲ级间变性胶质瘤9例,Ⅳ级胶质母细胞瘤12例。同时我们也收集了5例颅脑外伤病人行减压手术切除的脑组织作为正常对照。所有标本均提取总RNA和总蛋白,并制作冰冻切片,利用RT-PCR、Western blot及免疫组织化学方法分别从mRNA和蛋白水平检测G-CSF和G-CSFR的表达。RT-PCR结果显示G-CSF和G-CSFR mRNA在四种级别的胶质瘤中均有表达；Western blot和免疫组织化学结果显示G-CSFR蛋白在四种级别胶质瘤中也均能检测到。其中G-CSF和G-CSFR在7例Ⅰ/Ⅱ级,8例Ⅲ级和12例Ⅳ级胶质瘤中共表达。G-CSF和G-CSFR在四种级别胶质瘤中的表达水平差异不具有显著性。在作为正常对照的5例脑组织中均未检测到G-CSF和G-CSFR的表达。此外,我们还检测了G-CSF和G-CSFR在原代培养的胶质瘤细胞G0518、胶质瘤细胞系T98G以及原代培养的星形胶质细胞中的表达。结果显示G-CSF和G-CSFR在原代培养的胶质瘤细胞G0518和胶质瘤细胞系T98G中均有表达,而在原代培养的星形胶质细胞中则未检测到表达。以上结果说明G-CSF与G-CSFR在胶质瘤中高表达。2. G-CSF对胶质瘤细胞增殖、迁移及侵袭的影响为了研究G-CSF对胶质瘤细胞增殖、迁移及侵袭的影响,我们从恶性胶质瘤病人肿瘤组织中分离并培养细胞,构建原代培养胶质瘤细胞G0518,并采用胶质瘤细胞株T98G作为体外模型。利用外源性G-CSF刺激胶质瘤细胞,通过MTT法检测G-CSF对胶质瘤细胞活力的影响,结果显示,相对于对照组,G-CSF明显促进胶质瘤细胞活力,作用呈剂量依赖性,浓度为100ng/ml时促进作用最强。通过BrdU掺入实验、克隆形成实验、划痕实验、Transwell迁移和侵袭实验等实验方法,研究G-CSF对胶质瘤细胞增殖、迁移及侵袭的影响。结果显示,相对于对照组,外源性G-CSF明显促进胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭。3. G-CSF促进胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭的机制为了研究G-CSF促进胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭的机制,我们首先利用G-CSFR抗体中和G-CSFR,阻断G-CSF信号通路,结果显示相对于对照组,G-CSFR抗体明显抑制胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭,并促进细胞凋亡。这说明G-CSF通过与G-CSFR结合发挥作用。有研究报道G-CSF与G-CSFR的结合激活G-CSFR将胞外信号传到10胞内,后者进一步激活信号转导与转录激活因子3(Signal Transducer and Activator of Transcription3, STAT3)通路将信号向细胞核内传导。因此,为了进一步研究G-CSF促进胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭的机制,我们利用Western blot的方法,检测G-CSF对STAT3的活化的影响。结果显示,外源性G-CSF可以激活胞内STAT3,而且这种激活效应呈现出时间依赖性：磷酸化的STAT3(phosphorylated STAT3, P-STAT3)水平在G-CSF刺激5min即开始升高,15min达到高峰,1h左右回落至基础水平；G-CSFR抗体预处理则可以抵消外源性G-CSF对STAT3的激活效应。以上结果表明,G-CSF参与STAT3活化的调节。为了进一步研究STAT3通路活化与G-CSF在胶质瘤中作用的关系,我们利用实时定量PCR检测了外源性G-CSF和G-CSFR抗体对STAT3下游与增殖、凋亡、侵袭及血管形成相关靶分子基因表达的影响。结果显示外源性G-CSF促进STAT3下游靶分子Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2associated X protein, Bax)、B细胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/leukimia2, Bcl-2)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase2, MMP2)及MMP9的基因表达；G-CSFR抗体则抑制这些分子的表达,并引起Bax/Bcl-2的比值升高。这些结果提示STAT3信号通路参与G-CSF对胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭的调节。在本研究中,我们发现G-CSF与G-CSFR在胶质瘤中过度表达,不同级别的胶质瘤中表达无显著性差异。G-CSF促进胶质瘤细胞增殖、迁移及侵袭,提示G-CSF可能参与胶质瘤的恶性进展。G-CSFR抗体抑制胶质瘤细胞增殖、迁移及侵袭,提示G-CSFR可能是潜在的治疗靶点。G-CSF激活STAT3促进其下游与增殖、凋亡侵袭及血管形成相关的靶分子基因的表达,提示STAT3信号通路参与介导G-CSF对胶质瘤细胞增殖、迁移及侵袭的调节。二、褪黑素对胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭的影响及机制研究1.褪黑素对胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭的影响我们首先利用MTT法检测不同浓度褪黑素对胶质瘤细胞活力的影响。结果显示,无论1nM生理浓度还是1mM药理浓度的褪黑素处理24h均不影响胶质瘤细胞活力。台盼蓝拒染法结果显示,生理浓度和药理浓度的褪黑素对胶质瘤细胞存活无明显影响。然后,我们利用划痕试验和Transwell细胞侵袭实验检测褪黑素对胶质瘤细胞迁移和侵袭的影响,结果显示,1mM褪黑素明显抑制胶质瘤细胞的迁移和侵袭,1nM褪黑素则无此作用。以上结果说明褪黑素抑制胶质瘤细胞迁移和侵袭,不影响胶质瘤的增殖能力。2.褪黑素抑制胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭的机制研究为研究褪黑素抑制胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭的机制,我们首先利用实时定量PCR检测了褪黑素对胶质瘤细胞MMP2和MMP9表达的影响,结果显示,1mM褪黑素明显抑制胶质瘤细胞MMP2和MMP9的表达。上述结果提示,褪黑素可能通过抑制MMPs表达来抑制胶质瘤细胞侵袭。褪黑素是自由基清除剂,通过对胶质瘤细胞内ROS的检测,我们发现正常培养条件下,胶质瘤细胞能产生一定量的ROS,褪黑素处理后,胶质瘤细胞内ROS水平降低。上述结果表明褪黑素处理改变了胶质瘤细胞氧化应激状态,提示其可能对氧化应激通路产生影响。NF-kB是氧化应激通路重要的节点分子,受ROS调控,并能调节MMPs表达,因此,我们检测了NF-kB活化情况。Western blot结果显示NF-kB在正常培养条件下的胶质瘤细胞内持续活化,褪黑素可降低其活化水平。进一步研究发现,NF-kB活化抑制剂二硫代氨基甲酸吡咯烷(Pyrrolidine dithiocarbamate, PDTC)抑制胶质瘤细胞迁移和侵袭及MMP2和MMP9表达,且不影响胶质瘤细胞活力,与褪黑素作用相似。以上结果提示氧化应激通路参与褪黑素对胶质瘤细胞迁移和侵袭的调节。在本研究中,我们发现1mM褪黑素抑制胶质瘤细胞迁移和侵袭及MMP2和MMP9表达,但不影响胶质瘤细胞增殖。1mM褪黑素降低胶质瘤细胞内活性氧(ROS)水平并抑制NF-kB激活。NF-kB活化抑制剂在胶质瘤增殖、迁移和侵袭中的作用与褪黑素相似。以上结果表明褪黑素可能通过ROS/NF-kB/MMPs通路参与对胶质瘤细胞迁移和侵袭的调节,提示肿瘤细胞高氧化应激状态与其生物学行为相关,并且,上述结果为褪黑素可能成为胶质瘤的辅助治疗手段提供了理论基础和实验依据。