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研究意义:糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)的发病与治疗是目前临床上的热点与难点,其发病机制中涉及多种学说,集中于炎症机制、免疫机制、氧化应激、高代谢、高滤过和血流动力学改变等等,其中炎症及免疫机制得到广泛的认可,这与糖尿病肾病肾脏组织中发现了大量炎症细胞、炎症介质、免疫细胞等有关,而且除了经典的各种免疫细胞及炎症介质以外,肾脏固有细胞的免疫反应亦被激活,主动参与到免疫和炎症反应中,导致肾脏固有细胞自噬、凋亡等细胞学发生改变,从而导致临床疾病的发生。本研究从免疫学角度探讨糖尿病肾病大鼠足细胞的自噬、凋亡变化及调节通路,并应用雷帕霉素进行干预,探究DN的发病机制及雷帕霉素干预效果,为临床DN治疗提供实验学依据。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是近年来研究的热点,许多研究报道mTOR蛋白在细胞自噬、凋亡信号通路中占有枢纽地位。mTOR蛋白复合体分为mTORC1和mTORC2两种,两者组成、结构和功能不同,受上游信号蛋白调控后均可出现磷酸化,活化后的两种mTOR蛋白诱导下游分子出现磷酸化、泛酸化变化,从而调控细胞生长周期及mRNA转录,导致细胞自噬、凋亡水平发生改变。目前对mTOR活化的上游通路研究较多,如经典的PI3K-Akt-TSC1/2-mTOR信号通路和 LKB1-AMPK-TSC1/2-mTOR信号通路,而对mTOR活化后对其下游蛋白的表达与调控研究相对较少,在肾脏足细胞损伤的发病机制中研究更少。雷帕霉素作为特异性mTOR受体结合剂,可以抑制mTOR蛋白活化,从而调控糖尿病肾病状态下肾脏足细胞生长周期和功能。但是mTORC1和mTORC2受体对雷帕霉素的敏感性存在差别,故而产生的调控效果亦有区别,本研究重点研究mTORC1蛋白的下游调控通路。自噬是利用溶酶体对细胞自身体内的部分细胞质和细胞器进行一系列降解的过程,由自噬相关基因(ATG)执行精细的调控。自噬是细胞内一个重要的降解机制,也是真核细胞一种固有的生理功能,对维持细胞内环境和细胞生存至关重要,参与机体抗衰老、细胞分化、免疫反应、肿瘤病变等。诱导细胞发生自噬的因素有饥饿、细胞器损伤、DNA损伤、放疗、药物等。细胞受到这些因素损伤,细胞内受损的细胞成分周围会形成一种分隔膜,分隔膜逐渐延伸将受损的胞浆成分完全包裹,形成一种称为自噬体的结构;自噬体形成后被运输至溶酶体,二者融合形成自噬溶酶体,最终在溶酶体酶作用下被细胞降解利用。目前研究发现自噬调节涉及多种信号通路,其中以腺苷单磷酸活化蛋白激酶(AMPK)及mTOR信号通路为调控核心。本研究通过观察糖尿病肾病动物肾脏组织中足细胞自噬水平的变化及mTOR蛋白表达的变化,明确mTOR蛋白对自噬调控的途径。细胞凋亡在生物体的进化、内环境的稳定以及多个系统的发育中起着重要的作用,具有重要的生物学意义及复杂的分子生物学机制。凋亡过程受多基因严格控制,如Caspases家族、抑癌基因P53、Bcl-2家族、癌基因如C-myc等。随着分子生物学技术的发展,目前对多种细胞凋亡的过程有了相当的认识,但是不同细胞受不同因素影响,凋亡过程不尽相同,迄今为止凋亡过程确切机制尚不完全清楚。凋亡过程的紊乱可能与许多疾病的发生有直接或间接的关系,如肿瘤、代谢性疾病、自身免疫性疾病等,射线、药物等因素能够导致细胞凋亡发生改变。有研究报道,糖尿病肾病肾脏组织中足细胞存在异常凋亡过程,其调控机制错综复杂,经典的有膜受体通路、细胞色素C和caspases途径等,凋亡的同时亦有凋亡抑制分子存在,如P53,CrmA,IAPs,FLIPs以及Bcl-2家族等,共同对细胞凋亡过程进行调控。有研究报道糖尿病肾病肾脏足细胞存在凋亡,mTOR蛋白是否在此过程中发挥作用及作用机制值得我们进一步研究。我们通过观察DN大鼠肾脏足细胞的凋亡变化与mTOR蛋白之间的关系,寻找mTOR蛋白对足细胞凋亡进行调控的证据。目的:1.观察DN大鼠肾脏组织中足细胞自噬及凋亡的变化,检测自噬蛋白mTOR、S6K1、LC3II 及凋亡相关蛋白 Bax、Bcl-2、c-caspase3、c-caspase9,证实糖尿病肾病肾脏足细胞同时存在自噬和凋亡两种不同细胞死亡的病理过程。2.明确mTOR蛋白对足细胞自噬和凋亡的调控机制。3.RAPA可以与mTOR蛋白受体结合,对mTOR蛋白活化进行抑制,本研究力图证实RAPA是否通过抑制mTOR蛋白活化改善肾脏足细胞自噬和凋亡的变化,发挥对足细胞的保护作用。研究方法1.动物实验研究1.1各组糖尿病肾病大鼠临床指标的观察:选取雄性SD大鼠,体重150-200g,通过STZ腹腔注射,制备糖尿病肾病大鼠模型,随机分为三组,正常对照组(NC组)、糖尿病肾病组(DN组)、雷帕霉素组(RAPA组)。检测0、4、8、12周血肌酐、24h尿量及尿蛋白定量,观察大鼠临床指标变化,作为临床评价指标。1.2足细胞标志性蛋白podocin、nephrin在大鼠肾脏皮质中的表达:实验末麻醉后处死大鼠留取肾脏标本,免疫组化及免疫荧光定量PCR检测podocin、nephrin蛋白表达。1.3糖尿病肾病大鼠肾脏皮质中mTOR蛋白的表达检测:采用免疫荧光定量PCR及蛋白免疫印迹法检测mTORC1蛋白在各组大鼠肾脏组织中的表达。1.4 mTOR蛋白活化后对其下游蛋白表达的影响:分别采用免疫荧光定量PCR及蛋白免疫印迹法检测肾脏皮质中S6K1蛋白及LC3II蛋白的表达,结合电镜及免疫组化学检测足细胞损伤变化。1.5足细胞凋亡在糖尿病肾病大鼠肾脏组织中的表达:western blot检测凋亡相关蛋白 Bax、Bcl-2、c-caspase3 和 c-caspase9 的表达。2.细胞实验研究:2.1预实验:将足细胞置于不同浓度的葡萄糖培养基中,观察足细胞的生长状况,MTT法筛选出适合细胞实验的浓度作为后续实验的葡萄糖浓度标准。将不同浓度的RAPA加入培养基中,观察足细胞生长状况,MTT法筛选出适合实验要求的RAPA干预浓度。2.2高糖对体外肾脏足细胞凋亡的影响:体外培养肾脏足细胞,将足细胞分为两组:正常对照组(NC组)和高糖组(HG组)。NC组足细胞置于5mmol/L葡萄糖RPMI1640培养液中,HG组置于含350mmol/L葡萄糖RPMI1640培养液中,24小时后TUNEL法检测足细胞的凋亡变化。2.3流式细胞学观察不同浓度RAPA干预下足细胞凋亡的变化:将足细胞分为4组,置于35mmol/L的葡萄糖的培养基,并向培养基中加入RAPA(浓度ng/ml:0,5,10,15)处理细胞24h,设置分组:blank(正常完全培养基),Ong/ml组(35mmol/L葡萄糖的完全培养基),5ng/ml组(35mmol/L葡萄糖的完全培养基+5 ng/ml的雷帕霉素),1Ong/ml组(35mmol/L葡萄糖的完全培养基+10ng/ml的雷帕霉素),15ng/ml组(35mmol/L葡萄糖的完全培养基+15 ng/ml的雷帕霉素)。流式细胞学法检测足细胞凋亡变化。2.4 TUNEL检测高糖状态下足细胞凋亡的变化:根据流式细胞学检测结果,设置分组:Ong/ml组(35mmol/L糖的完全培养基),15ng/ml组(35mmol/L糖的完全培养基+15 ng/ml的RAPA)。TUNEL检测高糖状态下足细胞凋亡的变化及RAPA的保护作用。2.5Westernblot检测自噬蛋白的表达:根据流式凋亡结果,选择15ng/ml雷帕霉素进行后续western blot实验。将足细胞铺板,密度60%-80%,24h后直接加入35mmol/L葡萄糖的培养基,并向培养基中加入雷帕霉素(终浓度15ng/ml)处理细胞24h,设置分组:正常对照组(NC组)、HG组(35mmol/L葡萄糖的完全培养基),HG+RAPA组(35mmol/L葡萄糖的完全培养基+15ng/ml的雷帕霉素)。提取总蛋白,western blot 检测以下指标:mTORC1、S6K1、LC3II、Beclin-1。结果1糖尿病肾病状态下糖尿病肾病大鼠肾脏病变及足细胞的损伤:1.1各组大鼠生化指标检测:动物饲养实验前、实验中及实验末(0、4、8、12周),检测三组大鼠尿量、尿蛋白及血肌酐水平。结果显示,DN组大鼠尿量较其余两组增多,尿蛋白定量增加,血肌酐水平增加,肾功能受损明显;RAPA组大鼠以上指标较NC组增加,但较DN组改善。1.2各组大鼠病理学改变:电镜下观察三组大鼠肾脏足细胞病理学改变,DN组大鼠足细胞较NC组结构改变,足突消融,数量减少,系膜区基质增生,系膜细胞增殖,肾小球毛细血管滤过网出现局灶阶段性硬化;RAPA组大鼠足细胞及肾小球滤过膜较NC组病变明显,足细胞出现足突消融,结构改变,系膜区及肾小球滤过膜病变明显,但与DN组相比有明显改善。1.3各组大鼠足细胞标志蛋白的变化:结果显示,podocin、nephrin蛋白在DN组大鼠肾组织中表达显著减少,扩增倍数下降;RAPA组podocin、nephrin蛋白较NC组表达减少,较DN组改善。1.4自噬在各组大鼠肾脏皮质中的表达及RAPA的保护作用:通过western blot及免疫荧光定量PCR检测mTOR、S6K1及LC3II蛋白表达,结果提示,DN组大鼠肾脏组织中mTOR蛋白较NC组明显增加,RAPA组较DN组改善,而自噬体LC3II表达与之相反,DN组大鼠肾脏组织中LC3II较NC组减少,RAPA组改善;DN组大鼠肾脏组织中S6k1蛋白较NC组明显增加,RAPA组较DN组改善。1.5凋亡在各组大鼠肾脏皮质中的表达及RAPA的保护作用:通过western blot检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、c-caspase3、c-caspase9。结果提示,DN组大鼠肾脏组织中Bax/Bcl-2、c-caspase3、c-caspase9较NC组明显增加,RAPA组较DN组改善,凋亡因子在糖尿病肾病大鼠模型中表达明显,RAPA干预后凋亡因子表达出现下降,对肾脏足细胞有一定的保护作用。2体外细胞实验研究高糖状态下肾脏足细胞凋亡的变化、自噬蛋白在细胞中的表达:2.1预实验结果:MTT法筛选培养基高糖浓度。葡萄糖浓度设置:0、5、10、15、20、25、30、35、40mmol/L,结果表明,当糖浓度高于35mmol/L时,对细胞的抑制率达到100%,不适合细胞实验。在0-35mmol/L范围内继续筛选,葡萄糖浓度为35mmol/L时,细胞抑制率大约在20%左右,而在5 mmol/L或者10 mmol/L时,抑制率很低。MTT发筛选不同浓度RAPA对足细胞的影响。结果显示,葡萄糖浓度为35mmol/L条件下,当雷帕霉素为5到15 ng/ml时细胞活率有明显的上升趋势,时间点为24h为宜。2.2高糖状态下足细胞表型功能的变化:流式细胞仪检测足细胞表型功能变化。葡萄糖浓度35mmol/L状态下,肾足细胞铺板密度60%-80%,24h后直接加入35mmol/L的高糖的培养基,并向培养基中加入RAPA(浓度ng/ml:0,5,10,15)处理细胞24h,后送流式凋亡,设置分组:blank(正常完全培养基),0(35mmol/L糖的完全培养基),5(35mmol/L糖的完全培养基+5 ng/ml的RAPA),10(35mmol/L糖的完全培养基+10ng/ml的RAPA),15(35mmol/L糖的完全培养基+15 ng/ml的RAPA)。实验显示,RAPA浓度为5-15 ng/ml时的确对细胞凋亡有缓解作用,凋亡细胞比例明显降低。后续实验选择15ng/mlRAPA处理细胞,对相关蛋白进行检测。2.3 TUNEL检测高糖状态下足细胞凋亡的变化:根据流式细胞学检测结果,设置分组:HG组(35mmol/L糖的完全培养基),HG+RAPA组(35mmol/L糖的完全培养基+15 ng/ml的RAPA)。结果显示,HG组足细胞在200倍及400倍荧光显微镜下均可见凋亡小体,HG+RAPA组在同样倍数显微镜下凋亡小体数量减少,提示RAPA对高糖状态下足细胞凋亡有改善作用。2.4自噬蛋白在高糖状态下足细胞中的表达:western blot检测mTORC1、S6K1、LC3II/LC3I、Beclin-1等自噬蛋白,设置分组:HG组(35mmol/L糖的完全培养基)、HG+APA组(35mmol/L糖的完全培养基+15 ng/ml的RAPA)。结果显示,HG组足细胞中mTORC1、Beclin-1表达增加,S6K1、LC3II/LC3I蛋白表达水平减少,足细胞中自噬蛋白表达出现明显变化,细胞自噬减弱。HG+RAPA组足细胞中mTORC1、Beclin-1表达较HG组减少,S6K1、LC3II/LC3I蛋白表达较HG组增加,RAPA对足细胞自噬有改善作用。结论与创新性1.本研究明确了糖尿病肾病发病过程中,高糖可以诱导mTORC1蛋白表达增加,而mTORC1蛋白亦可以作为独立危险因素诱导自噬体标志性蛋白LC3II表达减少,提示两者之间存在联系。同时,在动物模型中我们也检测到Bax、Bcl-2、c-caspase3、c-caspase9等凋亡因子的表达增加,提示自噬、凋亡两者细胞变化存在一定联系。2.RAPA作为mTORC1蛋白特异性抑制剂,可以与mTORC1蛋白紧密结合,对mTORC1蛋白表达进行调控,从而达到保护病变足细胞的作用。3.mTOR蛋白与LC3II之间需要信号转导,S6K1作为mTOR蛋白的下游信号传导蛋白之一,可以对LC3II蛋白的表达进行调控,从而证明mTOR-S6K1-LC3II信号通路的存在。4.mTORC1蛋白表达与Bax、Bcl-2、c-caspase3、c-caspase9等凋亡因子的表达增加呈正相关,而且有研究提出mTORC1蛋白可以调控凋亡蛋白的表达,提示mTORC1蛋白在足细胞变化中发挥着重要作用。