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研究背景：雌激素及其受体（Estrogen Receptor，ER）信号系统在乳腺的发育和功能分化，以及疾病过程中有着非常重要的作用。乳腺的良恶性病变如乳腺囊性增生病、乳腺癌等都与ER信号系统的失调有关。自上个世纪六十年代Elwood V Jensen首次从理论上证实雌激素受体的存在以来，对于ER的研究一直没有间断过。雌激素受体有五个结构域，其激活途径主要有三种，包括经典的配体激活途径、非经典激活途径及磷酸化激活途径。ER与雌激素结合后形成配体-受体复合物，引发雌激素受体的构象改变形成二聚体并向细胞核内转位，并与靶基因上的作用元件ERE结合激活其转录；另外ER还可与AP1、SP1等结合激活相应的靶基因转录。除了配体结合激活途径外，ER还有多个磷酸化位点。这些位点大多位于AF1区，例如305位丝氨酸的磷酸化可使ER在未与配体结合状态下激活。但目前对于雌激素受体磷酸化位点与乳腺的发育、癌变等关系研究并不透彻。基因替代鼠（Knockin mice）是研究基因/蛋白特定位点功能的非常有效的途径和工具，可以建立人类疾病相关的动物模型，在研究探讨疾病的发病机制、相关基因分析、疾病预防等方面起到重要作用；也可以作为新药研发的重要评价体系。因此，基因替代鼠不仅有利于带动生命科学的前沿发展，也在医学研究中起到先导作用。王瑞安等人前期发现ER的305位丝氨酸（ER-S305）是一磷酸化位点。Pak1激酶和PKA激酶均可磷酸化这一位点。该位点的磷酸化可使ER在不与配体结合的状态下激活，因而可能参与乳腺的癌变并与乳腺癌对抗雌激素疗法的耐药性有关。本实验拟建立与人ER-S305位点同位的ER-S309A基因突变鼠，观察该磷酸化位点的消失对乳腺发育和癌变的影响，阐明ER在体内的调节机制，并进一步探讨该位点做为乳腺癌化学预防、治疗潜在靶点的可能性提供相关依据。目的通过建立ER S309A基因替代鼠，研究将该位点的丝氨酸突变为丙氨酸失去这一磷酸化位点后小鼠的乳腺发育情况。通过观察纯合型替代鼠的乳腺发育情况、动情周期的变化，及给予雌激素后乳腺发育和动情周期的改变，分析ER-S309位点的磷酸化及能够磷酸化这一位点的激酶分子在生殖功能和乳腺发育中的作用。方法1.建立ER-S309A基因替代鼠。剪尾提取总DNA，PCR扩增相应基因改变片段经基因测序确定替代鼠的建立是否成功。2.将杂合子小鼠相互交配。用PCR结合酶切分析鉴定基因型。分析子代小鼠的比例是否符合孟德尔遗传规律。并观察纯合型雌性小鼠及雄性小鼠是否具有繁育能力，如能繁育则观测雌性小鼠的哺育能力。3.分别测定纯合型与野生型雌性小鼠血中雌二醇的浓度。4.分别取6、9、12周龄的纯合型和野生型雌性小鼠的第3、4对乳腺卡红整装染色观察发育情况、HE染色观察动情周期的变化。5.野生型小鼠三周龄时行双侧卵巢去势手术后，分为给予雌激素组和对照组；纯合型突变小鼠三周龄开始给予雌激素，分别观察补充激素组和对照组小鼠第6、9、12周第4对乳腺卡红染色观察发育情况，HE染色观察动情周期变化。6.纯合型和野生型雌性替代鼠，取其双侧卵巢、输卵管HE染色，观察是否有形态学改变。结果1.基因测序结果显示309位的丝氨酸被丙氨酸所替代，表明我们成功建立了ER-S309A基因替代鼠。2.纯合型雄性小鼠不具有生育能力。雌性纯合型小鼠具有生育能力，但每窝的鼠仔数量较野生型雌性小鼠的每窝鼠仔数量有明显减少，表明生殖力降低。3.纯合型雌性小鼠血中雌二醇浓度同野生型雌性小鼠血中雌二醇浓度相比没有明显差异。4.纯合型雌性小鼠的乳腺发育较正常野生型小鼠慢，导管生长缓慢、分支减少，乳腺腺泡数目减少，终末蕾的数量和面积减少；纯合型小鼠的动情周期紊乱，角化细胞数量减少。5.野生型雌性小鼠去势后给予雌激素组乳腺可以正常生长，动情周期中出现明显的角化细胞；未给予雌激素的对照组乳腺卡红染色没有明显的导管生成，没有动情周期出现。纯合型雌性小鼠三周开始给予雌激素后导管生长速度加快、分支多，终末蕾的数量、面积增多；动情周期可见多量角化细胞。6.纯合型雌性小鼠卵巢和输卵管没有明显的形态学改变。结论1.ERS309A基因替代鼠的建立成功；2.失去ERS309A磷酸化位点后，雌激素受体功能降低，雄性小鼠丧失生殖功能；雌性小鼠生殖能力降低。3.纯合替代鼠血中雌二醇含量正常。4.动情周期中S309A替代鼠由于ER功能下降，阴道上皮角化细胞数量减少，给予雌激素后角化恢复；5.乳腺发育中S309A替代鼠乳腺导管由于ER功能下降，生长速度减慢、发育受阻。在高水平雌激素作用下，导管的发育缺陷可被纠正。