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第一部分、PHN大鼠足细胞损伤和凋亡的研究目的制备膜性肾病经典的动物模型被动Heymann肾炎(PHN),观察疾病进程中足细胞的损伤,探讨是否存在足细胞的凋亡。方法采用1月龄SPF级的SD雄性大鼠通过静脉注射兔抗大鼠FX1A抗血清建立大鼠PHN模型并随机分为4组:分别在模型建立后的第2、4、7、21天时处死大鼠并取材,每组8只;同时设立对照组,进行同样的处理。临床生化分析仪检测大鼠的血肌酐、尿素氮以及24小时尿蛋白总量;病理染色和透射电镜观察PHN模型鼠疾病进程中的病理改变和足细胞的损伤;免疫组织化学染色检测PHN大鼠肾小球内C5b-9随时间进展的沉积;足细胞标志蛋白WT1免疫组化染色标记足细胞并通过Weibel-Gomez方法计数单个肾小球足细胞数量,评估足细胞出现明显缺失的时间点;活性caspase3的免疫组化染色和tunel染色评估PHN大鼠肾小球足细胞的凋亡。结果(1)造模后第2天即可观察到C5b-9在肾小球基底膜部分阶段沉积,第4天起沿基底膜呈线状沉积,并随疾病进展沉积逐渐增多;PASM染色显示随疾病进展肾小球基底膜逐渐增厚至21天时呈现明显的局灶性阶段性增厚;透射电镜观察显示逐渐出现上皮下颗粒状电子致密物的沉积及足突融合,至第21天可见典型膜性肾病改变;尿蛋白定量结果显示,造模第3天起尿蛋白排出量即有明显升高,至第21天时可高达50.6±6.0mg/24h; (2)造模后第21天时观察到单位肾小球足细胞绝对数目的显著降低(vs对照组,p<0.05); (3)活性Caspase-3和TUNEL染色结果一致显示造模后第21天肾小球内可检出凋亡的足细胞。结论成功制备了膜性肾病的动物模型PHN,观察了膜性肾病典型的病理改变进程,足细胞损伤是其病变的核心环节,在造模后第21天时观察到足细胞的凋亡。第二部分、调控自噬对PHN大鼠足细胞损伤的影响目的 (1)观察不同时间点足细胞自噬激活的改变;(2)通过自噬增强剂雷帕霉素和抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)调控自噬,探讨调控足细胞自噬对PHN疾病进展和足细胞损伤的影响。方法 (1)制备PHN模型鼠,并在2、4、7、21天时分别处死;(2)制备PHN模型鼠,随机分为三组,分别给予生理盐水、雷帕霉素溶剂、3-MA溶剂干预,同时设立空白对照组和DMSO溶剂对照组,21天时处死大鼠并取材。透射电镜观察足细胞自噬泡数量的改变,western blot检测自噬标记蛋白的改变;全自动生化分析仪测定24h尿蛋白定量、血清BUN及Cr;免疫荧光染色检测肾小球内C5b-9的沉积;PASM染色和透射电镜观察肾脏病变和足细胞损伤;Weibel-Gomez方法计数单位肾小球足细胞数量;活性caspase-3的免疫组化染色观察凋亡的足细胞,western blot半定量分析肾小球内细胞的凋亡。结果 (1) PHN疾病进程中伴随着足细胞自噬的激活,自噬增强剂雷帕霉素和抑制剂3-MA可以起到调控足细胞自噬的作用。(2)调控自噬不会影响PHN模型鼠的损伤因素C5b-9在肾小球的沉积。(3)雷帕霉素增强自噬可以改善PHN大鼠肾小球基底膜增厚的程度和范围,减少肾小球固有细胞尤其是足细胞的凋亡,改善PHN大鼠足细胞的缺失,进而明显减轻PHN模型鼠蛋白尿的排出。(4) 3-MA抑制自噬明显加重PHN大鼠肾小球基底膜增厚的程度和范围,加重足细胞的损伤,足细胞凋亡明显增加,足细胞缺失更加明显,蛋白尿排除明显增加。结论在PHN的病变过程中,自噬发挥着保护作用,适度增强自噬可以减少足细胞的凋亡,进而减轻肾脏病变,缓解蛋白尿;相反,当自噬被抑制后,足细胞损伤加重,进而加重肾脏病变和蛋白尿程度,自噬可能是足细胞对抗补体介导的细胞损伤的机制之一。第三部分、自噬保护PHN大鼠足细胞的机制研究目的 (1)观察PHN疾病进程中足细胞内质网(ER)的损伤和内质网应激(ERS)激活的变化过程,推测其和足细胞凋亡及自噬的关系;(2)观察增强或者抑制自噬后ER损伤的改变及ERS信号分子的变化,探讨自噬减少PHN大鼠足细胞凋亡的可能机制。方法透射电镜观察足细胞ER的损伤;免疫印迹检测ERS相关蛋白的表达。结果 (1)足细胞的ER在PHN疾病进程中损伤逐渐加重,表现为内质网腔扩张、核糖体脱落等;(2) ERS相关蛋白在PHN疾病早期(第2天)表达上调,早于LC3表达上调的时间;(3)增强足细胞的自噬水平后ER损伤明显缓解并且ERS相关蛋白表达下调,足细胞自噬被抑制后ER的损伤明显加重同时ERS相关蛋白表达上调。结论自噬发挥减缓PHN疾病进程并减轻足细胞损伤的作用可能是通过缓解足细胞内质网应激的强度和持续的时间实现的,进而调控内质网应激的生存前信号和凋亡前信号通路,减少足细胞凋亡。调节“内质网应激一自噬”信号途径可能是治疗膜性肾病的新途径。