论文部分内容阅读
目的:2′-5′寡腺苷酸合成酶(2′-5′Oligoadenylate synthetase,OAS)启动子基因克隆及OAS启动子-pGL3-Basic载体构建,探讨OAS启动子在丙型肝炎特异性基因治疗中的应用。方法:①以报道的OAS基因启动子序列(-159到+82)为母板,设计两端含有限制性内切酶位点HindⅢ和SacⅠ的引物。以健康献血员基因组DNA为模板进行PCR扩增目的片段。②将分离纯化的PCR产物用T4 DNA连接酶与pGL3-Basic载体相连,转入JM109感受态大肠杆茵,筛选阳性克隆,进行HindⅢ和SacⅠ双酶切鉴定并测序。③将pcDNA3.1(-)/core重组真核表达质粒用脂质体转染入人胚胎肝细胞L02中,用RT-PCR和Western blot免疫印迹法检测丙型肝炎病毒核心蛋白的表达。④将OAS Promoter-pGL3-Basic vector瞬时转染入表达丙型肝炎病毒核心蛋白的L02细胞中,72h后检测荧光素酶的活性。结果:①酶切及测序证实成功克隆2’-5’OAS启动子基因,与GeneBank中2’-5’OAS启动子序列一致。②经测序、限制性酶酶切证实成功构建了携带有2’-5’OAS启动子的pGL3-Basic真核表达载体。③RT-PCR和Western blot免疫印迹法显示转染pcDNA3.1(-)-core真核表达质粒的L02细胞中有HCV-core蛋白的表达。④在表达丙型肝炎病毒核心蛋白的L02细胞中荧光素酶活性为未转染HCV-core表达质粒的L02细胞中荧光素酶活性的415倍。结论:①本实验成功克隆了长度为241bp的OAS启动子基因,并构建了OAS启动子-pGL3-Basic载体。②证实了丙型肝炎病毒核心蛋白对2′-5′OAS启动子有激活作用。③我们构建的OAS启动子能高效特异地启动下游基因的表达。④本研究构建的OAS启动子为丙型肝炎的基因治疗奠定了实验基础。