论文部分内容阅读
第一部分、AAL-63在感染性休克中发挥生物学效应的体内实验研究 目的：应用CLP诱导感染性休克小鼠动物模型，观察AAL-63腹腔注射后对发病小鼠的存活率、重要脏器损伤及主要固有免疫细胞的影响,明确AAL-63的生物学效应。 方法：纯化的突变株AAL-63经过多粘菌素B柱子(Polyminx B column)去除内毒素污染。CLP诱导C57BL/6成年雄性小鼠发生感染性休克，低剂量组选择近盲肠基底部3/4处结扎，造成重度感染性休克；高剂量组选择盲肠中段结扎，造成中度感染性休克。小鼠随机分成6组：SHAM组、SHAM+AAL-63（5或10mg/kg）、AAL-63（2.5mg/kg）组、AAL-63（5mg/kg）组、AAL-63（10mg/kg）组、PBS组，每组包括小鼠10只。AAL-63组小鼠于术前12小时及术后即刻分别经腹腔注射AAL-63总量的一半（低剂量组：2.5mg/kg，高剂量组：5mg/kg）和相同体积无菌PBS，SHAM组小鼠作为空白对照组，实施同样手术操作但不施行盲肠结扎及穿孔，小鼠持续观察至第7天，统计死亡率。同样的模型，CLP术后48小时，每组随机挑选5只小鼠麻醉后无菌收集血液、心脏、肝脏、肺脏、双侧肾脏、脾脏等，剩下的HE染色观察各器官病理学改变，ELISA法检测血清炎性细胞因子表达水平，FCA法检测小鼠脾脏巨噬细胞和DC数量及活化比率。 结果 1、低剂量AAL-63在中度感染性休克模型中对小鼠的存活率没有明显的影响,而在重度模型中减轻了小鼠死亡（P<0.05）；高剂量AAL-63在中度模型中促进了小鼠死亡（P<0.01）。 2、术后48小时低剂量AAL-63组小鼠心脏心肌细胞溶解、肝脏肝小叶的点状坏死、肺部肺泡壁的肺泡细胞增生及肾脏肾小球的细胞增殖等脏器损伤明显轻于低剂量PBS组；高剂量AAL-63组各脏器相应损伤明显重于高剂量组。 3、术后48小时低剂量AAL-63组小鼠血清TNF-α（P<0.001）、IL-6（P<0.001）、IL-1β（P<0.01）、IL-18（P<0.001）的分泌比低剂量PBS对照组显著降低；高剂量AAL-63组TNF-α（P<0.01）、IL-6（P<0.05）、IL-1β（P<0.001）、IL-18（P<0.001）的分泌比高剂量PBS组显著升高。 4、低剂量和高剂量AAL-63组与相应PBS组中CD11c+和CD11c+CD80+CD86+MHC-II+ DC数量都没有显著差别；低剂量AAL-63组与低剂量PBS组中CD11b+巨噬细胞数量无显著差异，但是显著下调了成熟的CD11b+F4/80+巨噬细胞数量（P<0.05）；高剂量AAL-63组提高了CD11b+巨噬细胞（P<0.05）和成熟的CD11b+F4/80+巨噬细胞的数量（P<0.01）。 结论： 1、AAL-63调控固有免疫反应具有剂量依赖效应，即不同的剂量可产生完全不同的免疫效应。 2、低剂量AAL-63减轻炎性细胞因子释放及脏器损伤，提高小鼠存活率；高剂量AAL-63加重炎性细胞因子释放及脏器损伤，降低小鼠存活率。 3、AAL-63不是通过树突状细胞发挥免疫效应，而是通过调控巨噬细胞的招募，从而调控巨噬细胞炎性细胞因子释放，起到调控固有免疫反应的作用。 第二部分、高剂量AAL-63在感染性休克中促进炎症反应的机制研究 目的： 通过不同剂量AAL-63体外刺激巨噬细胞，了解AAL-63在巨噬细胞表面的作用受体及信号传导途径，研究高剂量AAL-63发挥促进炎症反应的作用机制。 方法：C57BL/6成年小鼠处死后分离股骨，无菌分离出骨髓细胞，在含10％ FCS和M-CSF（20ng/ml）DMEM培养基培养7天得到成熟的BMDMs；RAW264.7细胞在含10% FCSDMEM培养基传代培养。不同剂量AAL-63刺激RAW264.7细胞后检测上清炎性细胞因子的分泌，以此确定AAL-63体外合适的实验浓度；同剂量AAL-63（40μg/ml）刺激RAW264.7细胞不同时间后检测上清炎性细胞因子的分泌，以此确定AAL-63体外合适的实验时间。实验分组：空白对照组、高剂量AAL-63组（和低剂量组）。应用Laminarin阻滞Dectin-1受体信号传导，TJ-M2010-5阻滞TLR受体下游MyD88信号传导。巨噬细胞与AAL-63共同孵育12小时，分别加入或同时加入或不加入两种阻滞剂及LPS，收细胞前半小时加入或不加入ATP，不同条件处理后收集细胞培养上清及细胞，直接用于实验检测或提取上清、整个细胞及细胞核蛋白用于实验。ELISA方法检测炎性细胞因子分泌水平，Western blot方法检测巨噬细胞表面受体、信号传导通路蛋白、核内转录及调控蛋白、FCA法检测巨噬细胞活化比率、共聚焦显微镜实验检测Hmgb1的转位、IP方法检测RelB表达、EMSA方法检测DNA与RelA结合力。 结果： 1、AAL-63浓度达到20μg/ml才能刺激巨噬细胞炎性细胞因子的分泌，浓度达到40μg/ml时炎性细胞因子的分泌达到高峰，随着浓度进一步增加时炎性细胞因子的分泌也不再增加（P<0.001）；AAL-63与巨噬细胞体外作用时间达到12小时炎性细胞因子的分泌达到高峰，随着浓度进一步增加时炎性细胞因子的分泌也不再增加（P<0.001）。 2、受体Dectin-1和 TLR-2分别或者联合抑制后没有影响AAL-63刺激巨噬细胞炎性细胞因子的分泌（P<0.001）；AAL-63呈剂量依赖性的促进Mincle受体的表达（P<0.01，P<0.001），而没有影响Dectin-1和TLR-2的表达，特别是分别或同时加入Laminarin或TJ-M2010-5后Mincle的表达不受影响（P<0.001）；高剂量AAL-63促进Mincle受体的表达（P<0.001），而不影响Dectin-1和TLR2的表达，特别是分别或同时加入Laminarin或TJ-M2010-5后Mincle的表达不受影响（P<0.001）；高剂量AAL-63增加BMDMs F4/80的表达，促进巨噬细胞的活化，且不受Dectin-1和TLR2抑制剂的影响（P<0.001）；高剂量AAL-63促进巨噬细胞胞浆p-Syk和Card9的表达增加（P<0.001）。 3、高剂量AAL-63诱导巨噬细胞内高水平的Nlrp3和pro-IL-1β的表达（P<0.001），同时增加细胞培养上清中活化p20的分泌（P<0.001），p20诱导IL-1β和IL-18在上清的分泌增加（P<0.001），高剂量AAL-63对pro-Caspase-1的表达没有影响。 4、高剂量AAL-63显著促进H3K4的二聚和三聚甲基化（P<0.001）；高剂量AAL-63诱导Hmgb1从细胞核内到细胞质的转位从而促进巨噬细胞Hmgb1的分泌（P<0.001）；高剂量AAL-63刺激降低巨噬细胞核蛋白中RelB的量导致NF-κB活性增高呈现RelA DNA结合能力增强。 结论： 1、AAL-63低剂量实验浓度为10μg/ml，高剂量实验浓度为40μg/ml。 2、AAL-63剂量依赖性调控巨噬细胞表面Mincle受体表达，激活Syk/Card9信号通路，将信号传入细胞核内调控炎性细胞因子的分泌。 3、高剂量AAL-63通过巨噬细胞Mincle受体激活Syk/Card9信号通路，同时伴随Nlrp3炎性小体的形成和Caspase-1的激活，以此促进巨噬细胞炎性细胞因子的分泌。 4、高剂量AAL-63促进H3K4的二聚及三聚甲基化及活化的Hmgb1转位分泌，进而促进炎症转录因子NF-κB活性，导致炎性细胞因子转录及表达增加，加剧CLP诱导的感染性休克的严重程度，增加了小鼠的死亡率。 第三部分、低剂量AAL-63在感染性休克中抑制炎症反应的机制研究 目的：通过体外刺激巨噬细胞，研究低剂量AAL-63发挥抑制炎症反应的作用机制。 方法：C57BL/6成年小鼠处死后分离股骨，无菌分离出骨髓细胞，在含10% FCS和M-CSF（20ng/ml）DMEM培养基培养7天得到成熟的BMDMs；RAW264.7细胞在含10% FCSDMEM培养基传代培养。实验分组：空白对照组、低剂量AAL-63组。巨噬细胞与AAL-63共同孵育12小时，同时加入LPS，收细胞前半小时加入或不加入ATP，不同条件处理后收集细胞培养上清及细胞，直接用于实验检测或提取上清、整个细胞及细胞核蛋白用于实验。ELISA方法检测炎性细胞因子分泌水平，Western blot方法检测巨噬细胞表面受体、信号传导通路蛋白、核内转录及调控蛋白、FCA法检测巨噬细胞成熟比率IP方法检测RelB表达、EMSA方法检测DNA与RelA结合力。 结果： 1、低剂量AAL-63组LPS刺激BMDMs炎性细胞因子的分泌明显降低（P<0.01，P<0.001）；低剂量AAL-63组BMDMs的F4/80表达明显降低（P<0.001）； 2、低剂量AAL-63刺激巨噬细胞后Mincle受体、p-Syk和Card9的表达显著增加（P<0.01，P<0.001）。 3、低剂量AAL-63显著促进巨噬细胞内H3K9的二聚和三聚甲基化（P<0.001）；在低剂量AAL-63刺激的巨噬细胞核蛋白中RelB的含量显著升高（P<0.001）；低剂量AAL-63降低了DNA结合RelA的能力。 结论： 1、低剂量AAL-63剂量调控巨噬细胞表面Mincle受体表达，激活Syk/Card9信号通路，将信号传入细胞核内调控炎性细胞因子的分泌。 2、低剂量的AAL-63诱导H3K9的的二聚及三聚甲基化，促进RelB与Hmgb1形成复合体，从而抑制DNA与RelA结合及炎性因子的转录，减轻CLP诱导的感染性休克的严重程度，降低了小鼠的死亡率。