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水稻条纹病毒(Ricestripevirus,RSV)引起的水稻条纹叶枯病近年来在我国广大水稻产区暴发流行,给水稻生产造成了严重损失。RSV是纤细病毒属(Tenuivirus)的典型成员,病毒基因组由4条ssRNA组成,编码7个蛋白,由灰飞虱(LaodelphaxstriatellusFallén)以持久方式传播。为了探讨RSV外壳蛋白(coatprotein,CP)和病害特异性蛋白(disease-specificprotein,SP)基因在真核生物细胞中的蛋白表达量及其功能,本研究利用融合表达荧光标记基因的方法在本氏烟上进行了RSVCP和SP基因的瞬时表达,并采用激光共聚焦观察了其在烟草叶片表皮细胞中亚细胞定位及两个蛋白的共定位。此外,为了研究RSV与传播介体灰飞虱互作过程中灰飞虱体内的免疫反应,本研究还通过Real-timePCR分析了灰飞虱体内免疫相关基因mucin表达量与RSV侵染之间的相关性。
RSVCP和SP基因分别与GFP基因融合后,构建至pCHF3植物双元表达载体,采用农杆菌介导的方法在本氏烟叶片上进行瞬时表达。为了明确GFP基因在表达载体中的位置对目的蛋白表达量的影响,同时构建了pCHF3-CP-GFP、pCHF3-GFP-CP、pCHF3-SP-GFP及pCHF3-GFP-SP融合表达载体。农杆菌介导进行瞬时表达后,紫外灯下观察及Western-blot分析表明GFP融合蛋白均得到了有效表达,但GFP在表达载体中的融合位置对基因的表达量无明显影响。为了增强目的基因的表达量,将基因沉默抑制子P19与融合载体共浸润本氏烟,结果发现P19能明显增强GFP的荧光强度,Western-blot结果也显示融合蛋白的表达量明显增加,表明与基因沉默抑制子共浸润可以增加目的蛋白的表达量。
为了进一步分析CP和SP在本氏烟叶片中的亚细胞定位,本研究还构建了pCHF3-GFP-CP和pCHF3-RFP-SP融合表达载体。激光共聚焦显微镜观察结果表明CP和SP单独浸润时都主要定位于细胞核、细胞膜和细胞壁上。而GFP-CP与RFP-SP共浸润本氏烟后CP和SP的定位有所改变,CP主要定位于细胞壁上,并呈点状分布;SP则只在细胞壁上形成类似内含体的结构,并与CP存在共定位现象。共同的亚细胞定位表明CP和SP两者间可能存在互作。
为了研究传播介体灰飞虱体内与RSV侵染相关的免疫反应,本研究根据相关序列设计引物RT-PCR扩增了灰飞虱体内的免疫相关基因,其中只有mucin能够得到特异性扩增,且无毒灰飞虱和带毒灰飞虱体内均有mucin基因的表达。采用Real-timePCR进一步分析灰飞虱饲毒0h、8h、24h、96h后mucin基因的表达量变化。结果表明,随着饲毒时间的延长,灰飞虱体内病毒量明显增加,同时mucin基因表达量也明显增加。RSV侵染后mucin基因表达量上调,暗示其可能在抵抗RSV侵染过程中起作用。