碱茅(Puccinellia tenuiflora)蔗糖非酵解型蛋白激酶(PutSnRK2)的功能解析

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SnRK2(sucrose non-fermenting1-related protein kinase2)是一类植物中特有的丝氨酸/苏氨酸类蛋白激酶,已经在许多植物中克隆出来。是SnRK家族中三个亚家族(SnRK1、SnRK2、SnRK3)之一。它们是一类丝氨酸/苏氨酸类蛋白激酶,可以对不同的逆境信号做出响应,在植物抗逆生理中发挥重要的作用。本研究以碱茅SnRK2成员PutSnRK2为研究对象,通过研究其氨基酸序列、表达特性、亚细胞定位、重组蛋白的纯化,并结合转基因植株在不同胁迫下的抗性研究结果,对其功能进行分析。  首先,对PutSnRK2基因的氨基酸序列进行生物信息学分析。结果表明,该基因家族成员都含有Ser/Thr蛋白激酶的核心功能域;同源比对分析和聚类结果显示该基因家族和已报道的拟南芥、水稻的SnRK2基因家族具有高度的相似性;并且它与水稻的亲缘关系最近,与水稻SAPK7亲缘关系在75%左右,同属于SnRK2b家族。接下来,为了了解碱茅中PutSnRK2基因的表达模式,我们利用实时荧光光定量PCR的方法分析了PutSnRK2基因在NaHCO3、NaCl、ABA和PEG等处理条件下的表达情况。结果表明,在这些胁迫下,PutSnRK2基因在叶、根中均受到显著诱导。在叶中,都表现出下调趋势;在根中,都表现出上调趋势。说明PutSnRK2基因与逆境胁迫都存在一定的应答关系。然后为了探求PutSnRK2蛋白的表达位置,通过提取转基因拟南芥植株原生质体的方法,利用荧光显微镜观察PutSnRK2-GFP蛋白在细胞中的亚细胞定位。结果表明,PutSnRK2-GFP融合蛋白定位于细胞质中。  此外,为了研究PutSnRK2蛋白的功能,构建了PutSnRK2基因的原核表达载体,将其转化大肠杆菌BL21(DE3),经诱导表达纯化得到GST-PutSnRK2融合蛋白,为后续试验分析PutSnRK2蛋白的激酶活性、验证蛋白间的相互作用等实验奠定了基础。最后,为了进一步分析PutSnRK2基因的功能,对转基因拟南芥植株进行抗性分析,通过观察植株的表型差异发现:正常条件下,过表达GFP基因和PutSnRK2基因的拟南芥比野生型生长略缓慢;在胁迫条件下,与野生型相比,过表达PutSnRK2基因的拟南芥对盐、PEG的耐受性显著提高。  综上所述,这些结果初步预示了PutSnRK2参与抗逆相关生理过程,为进一步研究它的功能奠定基础。
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