论文部分内容阅读
目的：脑神经胶质瘤是一种最常见的中枢神经系统恶性肿瘤,术后化疗是目前治疗脑肿瘤的主要手段。但是由于正常脑组织中血脑屏障(blood-brain barrier,BBB),以及肿瘤组织中血肿瘤屏障(blood-tumor barrier,BTB)的存在,严重限制了抗肿瘤药物进入到肿瘤组织。因此有效地增加肿瘤组织中抗肿瘤药物的浓度,是提高化疗药物疗效的关键。
内皮-单核细胞激活多肽Ⅱ(endothelial-monocyte activating polypeptideⅡ,EMAPⅡ)是从甲基胆蒽A诱导形成的纤维肉瘤细胞的上清中发现的致炎因子,具有促进细胞凋亡和抑制肿瘤血管生成的特性。目前EMAPⅡ主要被用于肿瘤治疗的实验研究。有研究表明低剂量的EMAPⅡ可以通过调节内皮细胞上的肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNT)受体1,增加TNFα对肿瘤微血管内皮细胞的作用,TNFα不仅能够抑制肿瘤的生长、侵袭,还可以在一定程度上增加BBB的通透性。
RhoA/ROCK信号通路在内皮细胞通透性的改变中起主要的调控作用,并且丝状肌动蛋白(filamentous actin,F-actin)细胞骨架结构的变化是调节内皮细胞通透性的重要机制。有研究发现,EMAPⅡ可诱导人脐静脉内皮细胞骨架蛋白F-actin的重排,使肌动蛋白形成广泛的应力纤维和更多的粘着斑。肌动蛋白的结构和功能的变化能够影响内皮细胞间紧密连接(tight junction,TJ)复合体,进而影响BBB的通透性,当肌动蛋白的应力纤维和粘着斑形成增加时,会通过影响TJ相关蛋白以及细胞骨架蛋白开放TJ,从而引起BBB的通透性增加。
本研究的目的是研究EMAPⅡ是否能够增加脑胶质瘤BTB的通透性,以及RhoA/ROCK信号通路是否参与这一过程。
方法：
1、大鼠C6胶质瘤模型和体外BTB模型的制备。
2、应用伊文思兰(evans blue,EB)渗透评估EMAPⅡ作用后脑胶质瘤大鼠BTB渗透性变化。
3、测量体外BTB模型的跨内皮阻抗(transendothelial electric resistance,TEER)值和辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)流量,检测给予EMAPⅡ作用后以及RhoA特异性抑制剂肉毒梭菌C3胞外酶(Clostridium botulinum C3exoenzyme)和Rho激酶(Rho associated Kinase,ROCK)特异性抑制剂Y-27632预处理后体外BTB通透性的变化。
4、应用RT-PCR、免疫组织化学法及western blot法检测给予EMAPⅡ作用后大鼠C6胶质瘤模型中微血管TJ相关蛋白ZO-1、occludin和claudin-5的mRNA以及蛋白表达水平变化。
5、应用免疫荧光法检测给予EMAPⅡ作用1h后以及C3胞外酶、Y-27632预处理后,ZO-1、occludin、claudin-5以及F-actin的分布和表达水平的变化。
6、应用western blot法检测EMAPⅡ作用后及C3胞外酶、Y-27632预处理后体外BTB模型上TJ相关蛋白ZO-1、occludin和claudin-5的蛋白表达水平;并且检测磷酸化的肌球蛋白轻链(myosin light chain,MLC)、肌动蛋白素(cofilin)和总MLC、cofilin的表达。
7、应用Pull-down方法检测体外BTB模型上EMAPⅡ作用后RhoA活性变化。
结果：
1、成功建立了大鼠C6脑胶质瘤模型和体外BTB模型。
2、EMAPⅡ作用后,C6脑胶质瘤大鼠BTB通透性增加,体外BTB模型的TEER值显著降低,HRP流量显著增加。上述指标在EMAPⅡ作用1 h时变化最明显。体外BTB模型中经C3 exoenzyme或Y-27632预处理后,TEER值以及HRP流量均显著恢复。
3、EMAPⅡ作用后,C6脑胶质瘤大鼠脑组织中微血管TJ相关蛋白ZO-1、occludin和claudin-5的mRNA和蛋白表达均减少,在1 h时达最低值。体外BTB模型中上述蛋白的表达变化与在体的变化一致。
4、EMAPⅡ作用后,体外BTB模型上的内皮细胞TJ相关蛋白ZO-1、occludin和claudin-5由连续分布状态变为不连续分布,ZO-1、occludin和claudin-5在细胞边缘表达水平下降并且发生由细胞边缘向细胞质的转移;细胞骨架蛋白F-actin沿细胞边缘的分布减少,应力纤维增加。C3胞外酶和Y-27632预处理后,内皮细胞中ZO-1、occludin和claudin-5部分恢复连续分布状态,并且三者的表达水平显著恢复;F-actin沿细胞边缘的分布明显增多,应力纤维明显减少。
5、EMAPⅡ作用后,体外BTB模型上的内皮细胞RhoA活性从0.25 h开始增加,0.5 h达峰值,之后逐渐减少。
6、EMAPⅡ作用后,体外BTB模型上的内皮细胞MLC和cofilin磷酸化水平从0.25 h时开始增加,1 h时达峰值,之后逐渐减少。C3胞外酶或Y-27632预处理后MLC和cofilin磷酸化水平显著恢复。
7、不同病理级别人脑胶质瘤中MMP-7和MMP-14的表达与ERK1/2的磷酸化显著正相关。
讨论：
本研究首次证明,EMAPⅡ作用后,BTB通透性显著增加,TJ相关蛋白ZO-1、occludin和claudin-5的mRNA和蛋白表达均显著减少,在EMAPⅡ作用1 h达最低值,TJ相关蛋白和细胞骨架蛋白F-actin的分布也发生改变,并且RhoA活性、MIC和cofilin磷酸化水平显著升高。应用RhoA的特异性抑制剂C3胞外酶和ROCK的特异性抑制剂Y-27632进行预处理后,显著抑制了BTB的通透性升高,显著抑制了TJ相关蛋白ZO-1、occludin和claudin-5的表达降低,明显改变了TJ相关蛋白的重分布和细胞骨架F-actin的重排,显著抑制了MLC和cofilin磷酸化水平的升高。上述结果说明EMAPⅡ能够通过下调TJ相关蛋白ZO-1,occludin和claudin-5的表达选择性增加BTB通透性;并且RhoA/ROCK信号通路在EMAPⅡ介导的BTB通透性增加的过程起重要的调节作用;RhoA/ROCK通路的下游信号分子MLC和cofilin也参与了上述调节过程。
以往的研究表明,小剂量缓激肽(bradykinin,BK)能够有效增加BTB通透性,而不影响正常脑组织。尽管小剂量BK能够显著增加BTB通透性,但是其增加BTB通透性的持续时间短暂,大约20分钟。因此,小剂量BK作为一种增加BTB通透性的物质,其临床应用受到限制。本研究结果显示EMAPⅡ作用后,BTB通透性从0.5 h开始增加,在1 h达到峰值,然后降低,6 h后基本恢复到未处理前水平。我们发现EMAPⅡ增加BTB通透性的持续时间明显长于BK的作用时间。因此,这一发现可能为选择性开放BTB以及增加抗肿瘤药物转运至肿瘤组织提供了新方法。
研究表明TJ是维持体内BBB完整性的重要结构和功能基础,并且在调节细胞旁通透性方面起重要作用。在BBB中,位于内皮细胞之间的TJ复合物是由如下蛋白组成的,occludin,claudins,Zos和连接粘附分子,这些结构的改变在调节TJ功能方面起重要作用。最近的研究显示,F-actin在TJ复合物的结构支持和功能调节方面起重要作用。本研究结果显示,EMAPⅡ作用后TJ相关蛋白ZO-1,occludin和claudin-5的mRNA和蛋白表达显著降低,最低水平出现在EMAPⅡ作用后1 h,上述TJ相关蛋白由连续分布状态变为不连续分布状态,发生由细胞边缘向细胞质转移;细胞骨架蛋白F-actin沿细胞边缘的分布减少,应力纤维增加。因此,我们认为EMAPⅡ能够通过影响细胞骨架蛋白F-actin的重排进而调节TJ相关蛋白ZO-1,occludin和claudin-5的结构和功能,最终引起TJ开放。
研究表明在一些细胞外刺激下,TJ能发生快速分解和重组。RhoA/ROCK信号通路是细胞外信号诱导细胞骨架蛋白F-actin重排的分子开关,参与内皮细胞通透性的调节。有研究发现,EMAPⅡ可诱导人脐静脉内皮细胞骨架蛋白F-actin的重排,使肌动蛋白形成广泛的应力纤维和更多的粘着斑。当肌动蛋白的应力纤维和粘着斑形成增加时,会通过影响TJ相关蛋白以及细胞骨架蛋白开放TJ,从而引起BBB的通透性增加。本研究结果显示EMAPⅡ作用后,RhoA活性、MLC和cofilin磷酸化水平均升高。应用RhoA的特异性抑制剂C3胞外酶和ROCK的特异性抑制剂Y-27632进行预处理后,显著抑制了BTB通透性的升高,显著抑制了TJ相关蛋白ZO-1、occludin和claudin-5表达的降低,显著抑制了TJ相关蛋白的重分布和细胞骨架F-actin的重排,显著抑制了MLC和cofilin磷酸化水平的升高。上述结果说明RhoA/ROCK-MLC通路和RhoA/ROCK-cofilin通路参与EMAPⅡ介导的细胞骨架蛋白F-actin重排,TJ相关蛋白表达降低及重分布以及BTB通透性增高的过程。
上述结果证明,EMAPⅡ能够通过下调TJ相关蛋白ZO-1,occludin和claudin-5的表达选择性增加BTB通透性,并且RhoA/ROCK信号通路在EMAPⅡ介导的BTB通透性增加的过程起重要的调节作用。RhoA/ROCK通路的下游信号分子MLC和cofilin也参与了上述调节过程。
结论：
1、EMAPⅡ能够选择性增加BTB通透性。
2、EMAPⅡ增加BTB通透性,可能与EMAPⅡ显著降低TJ相关蛋白ZO-1,occludin,claudin-5的mRNA和蛋白表达水平相关。
3、RhoA/ROCK信号途径参与EMAPⅡ选择性增加BTB通透性的调节过程。
4、MLC和cofilin参与EMAPⅡ增加BTB通透性的调节过程,且为RhoA/ROCK的下游信号因子。
5、不同病理级别人脑胶质瘤中MMP-7和MMP-14的表达与ERK1/2途径的激活相关。