D1蛋白酶的克隆表达、纯化、生物活性测定及抗体的制备

• 作 者: 李慧
• 机 构: 华中师范大学
• 出 处: 华中师范大学
• 发表日期: 2010年期
• 关键词: D1蛋白酶 克隆表达 生物活性 基因工程 抗体制备

D1蛋白酶(D1 C-terminal processing protease，CtpA)是由叶绿体核ctpA基因编码，主要用于酶切D1蛋白前体羧基端延伸的肽段，使D1蛋白前体转变为成熟的D1蛋白，从而用于光合系统Ⅱ中锰簇合物的组装，具有维持光合系统Ⅱ损伤-修复循环过程的重要作用，该酶切过程是植物进行光合作用必不可少的步骤。因此，D1蛋白酶被认为是一个新型优异的广谱除草剂作用靶标。为了开发以D1蛋白酶作为靶标的新型除草剂，需要对先导化合物的生物活性进行检测和筛选。由于该蛋白在天然蛋白中的含量较低，所能提取得到的酶蛋白总量也有限，因此采用基因工程的方法可获得稳定来源的酶蛋白，以供大规模的筛选所需。　　
本文通过基因工程方法，选用大肠杆菌原核表达系统表达菠菜CtpA蛋白。从菠菜中提取总RNA，逆转录合成cDNA，采用聚合酶链式反应(PCR)扩增了CtpA的基因，分别连接至表达载体pET-23a和pET-28a中，并在大肠杆菌BL21(DE3)中进行高效表达。结果表明重组质粒pET-23a-CtpA在0.2 mmol/L IPTG，8℃诱导培养72小时条件下，重组质粒pET-28a-CtpA在0.1 mmol/L IPTG，8℃诱导培养72小时条件下，重组蛋白均可获得高效表达。分别采用Ni-NTA亲和层析法对重组蛋白进行了纯化，SDS-PAGE和Western blotting印迹结果证实目的蛋白为含有His-tag的融合蛋白。以合成的D1前体蛋白羧基端24肽作为模拟底物，采用高效液相色谱法测定了其水解活性，结果表明活性可达1.10 nmol/(mg·min)，为文献报道数据的15倍。采用纯化后的CtpA蛋白免疫日本长耳大白兔制备了多克隆抗体、免疫Balb/c雌鼠制备了单克隆抗体，ELISA法测定二者血清抗体的效价均高达1∶100000，共得到4株单克隆抗体细胞株。所得结果为抑制剂先导化合物的筛选和酶蛋白与化合物的作用机理研究提供了必要的基础。