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随着现代工业、农业和养殖业高速发展,环境污染问题日益严重。据2018年中国环境状况公报报道,氮污染位于众多污染首位。人类活动对氮循环的干扰极大地加速了地球生态环境的变化,引发严重的氮循环失衡、氮污染加剧、温室气体排放增多等不良效应,及时有效地解决氮污染问题刻不容缓。微生物在治理氮污染等方面发挥了重要的作用,氨氧化是氮污染治理的重要环节,目前研究和应用的氨氧化菌主要是从环境中分离纯化的菌株,或者克隆某种单一微生物的氨氧化酶基因(amoA)构建其工程菌。为了进一步提高氨氧化菌(AOB)的筛选效率,本文构建了环境样品自养氨氧化菌群amo A基因文库,通过对重组子活性的筛选,获得高活性AmoA,进一步采用定向进化技术,构建amoA突变文库并筛选高活性AmoA重组子,将筛选到的amoA与羟胺氧化酶基因(hao)在宿主菌种共表达,以期获得高活性AOB。本研究的主要结果如下:(1)氨单加氧酶(AmoA)初筛体系的建立:以Pseudomonas(P.)aeruginosa ATCC9027的amoA,构建工程菌E.coli BL21(amoA),建立了一种原位测定AmoA活性的方法,挑取重组子于96孔板培养12 h,直接加入终浓度为10 mg/L溶菌酶处理1 h,再直接加底物和检测试剂,测定酶活。该方法重复性良好(RSD为4.8%),易于实现高通量筛选,为基因文库法筛选高活性AmoA重组子奠定基础。(2)amoA文库的构建及重组子的筛选:依据3属15种34菌株自养氨氧化细菌amoA全长序列设计简并引物,以环境样品基因组DNA为模板,扩增amoA基因,构建基因文库。经过初筛和复筛,得到4个高活性的重组子,其中重组菌UA146活性最高。以E.coli BL21作为宿主菌,将筛选的高活性重组子的amoA基因与hao基因共表达,筛选获得1株高活性氨氧化重组菌,编号为UA146-H10。该菌株在100 mg/L氨氮测定体系中作用60 h,对氨氮的去除率为75.8%,明显地检测到硝氮积累,可达0.11 mg/L。(3)amoA突变文库的构建及高活性AmoA的筛选:选用重组菌UA146的amoA,通过易错PCR定向进化技术,构建amoA基因突变体文库,筛选出高活性的氨单加氧酶AmoA,再将高活性的amoA和hao克隆子同时转入到E.coli BL21中,筛选出1株氨氧化能力最强的重组菌,编号为Er-UA1090-H19,该菌株在氨氮浓度为100 mg/L时,反应36 h后氨氮的去除率即达到最大,为97.95%,去除率为突变前的1.28倍。在乙醇、乙酸钠、乳糖、葡萄糖等小分子有机碳源存在时,该突变菌株能有效地去除氨氮,积累少量硝氮,以葡萄糖为碳源时,氨氮(100 mg/L)去除率最高,可达96.1%。高浓度尿素或蛋白胨等有机氮源存在时,该菌株具有良好的去除氨氮的作用,高浓度酵母浸提物则对氨氮的去除具有抑制作用。综上,本研究建立了一种氨单加氧酶高通量活性筛选体系,通过构建基因文库以及定向进化技术,筛选出一株具有高氨氧化能力的大肠杆菌工程菌ErUA1090-H19和amoA基因,本研究为进一步选育高活性脱氮菌株或基因提供借鉴。