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植物真菌病害一直是影响农作物产量,降低农作物品质的主要原因,西瓜[Citrulluslanatus(Thunb.)Mantsum.etNakai]和甜瓜(CucumismelonLinn.)是经济价值很高的水果,其栽培面积和产量我国在世界上均占首位,但其病害种类繁多,尤其以真菌性病害最为严重,是瓜类生产中存在的主要问题。在植物抗病基因工程中,通过将抗真菌蛋白基因转入植物来提高农作物对真菌病害的抵抗能力已成为一种直接有效的方法,虽然植物抗病基因工程在一些重要农作物改良中取得了一定进展,但是由于瓜类遗传基础狭窄、抗病种质资源缺乏、抗病遗传规律的复杂性和西瓜、甜瓜存在组培再生困难、试管苗移栽成活率低和遗传转化体系较难优化等问题,使基因工程在瓜类作物的抗病遗传育种应用受到限制,因而这方面的应用研究起步较慢。
我们系统研究了西瓜、甜瓜组织培养体系,优化了农杆菌介导的西瓜、甜瓜遗传转化体系.构建了含有烟草的几丁质酶基因(CHI)和烟草β-1,3-葡聚糖酶基因(GLU)和小麦的硫堇蛋白基因(THI)的三价抗真菌融合基因植物表达载体转化西瓜、甜瓜,成功地获得了9株转基因甜瓜和7株转基因甜瓜株系,并进行了相关分子生物学鉴定,期望从中筛选出抗病性增强的品种来为常规育种提供材料,以求在生产上达到提高瓜类对真菌病害的抵抗能力。主要实验结果如下:
1建立了高效西瓜、甜瓜组织培养体系①茎尖与子叶切块可诱导分化不定芽,愈伤组织也可诱导不定芽分化,但频率很低,真叶、下胚轴和茎段仅能诱导出愈伤组织。
②建立了以西瓜、甜瓜子叶块为外植体的不定芽分化再生体系,其最适培养基分别为MS+6-BA1.0mg/L+IBA0.5mg/L和MS+6-BA2.0mg/L+IBA0.5mg/L,在最适培养基上二者的不定芽诱导率分别可达91.2%和94.3%.
③一定浓度的6-BA是诱导瓜类子叶块外植体分化的关键,基因型不同的诱导率不同,但对于瓜类不同品种而言,附加低浓度的IBA则有利于这种分化的发生,无激素培养基上的外植体则不能诱导出不定芽。
④无菌苗子叶颜色由黄色转呈浅绿色时的子叶块最适合于不定芽的诱导,诱导率最高。
⑤西瓜、甜瓜再生植株生根较易,低浓度IBA(0.5mg/L)即可较好的诱导形态正常、有明显根毛的不定根。NAA也能诱导西瓜生根,但对甜瓜效果很差。
2优化农杆菌介导遗传转化体系①西瓜、甜瓜子叶块外植体对卡那霉素非常敏感,卡那霉素对外植体的生长和分化有明显的抑制作用,80mg/L是适宜的筛选压力,头孢霉素和氨苄青霉素在高浓度500mg/L时,对外植体的生长分化无明显影响,均可用于侵染后的脱菌和抑菌过程。
②根癌农杆菌菌株EHA105比LBA4404对西瓜有较高的转化率,对甜瓜转化率差异不明显。
③预培养是获得较高西瓜、甜瓜转化率必要条件,共培养时间以3-4d为宜,菌液浓度OD600值在0.3-0.5左右时,转化效率最高,侵染时间以15-20min为最佳。乙酰丁香酮(AS)对西瓜、甜瓜的转化效果不显著。
3西瓜、甜瓜的遗传转化①抗真菌基因植物表达载体:构建了PNZIP::FG1植物表达载体:将35S::FG1表达载体中的35S启动子替换为PNZIP启动子。
②利用农杆菌介导法将融合基因FG1转入西瓜、甜瓜,共获得16株转基因植株。PCR鉴定和Nouthern杂交分析结果表明外源基因己成功整合到西瓜、甜瓜基因组中并得到表达。
③对获得的转基因植株,进行了抗病性检测,采用离体叶片和田间接种灰霉、炭疽、和西瓜枯萎病菌,实验结果表明转基因西瓜和甜瓜株系中,转基因甜瓜和基因西瓜比对照植株表现出高抗真菌的甜瓜两株西瓜一株,抗病株系甜瓜3株,西瓜3株。
④转FG1基因西瓜、甜瓜接炭疽菌后,测定了几丁质酶,β-1,3-葡聚糖酶的酶活性,发现高抗转基因株系的酶活性比对照非转基因植株高5-6倍。