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目的:将人的免疫细胞注射给重症联合免疫缺陷(Severe Combinedimmunodeficient mice,SCID)小鼠,重建实验所需免疫环境,建立人外周血淋巴细胞Hu-PBL-SCID小鼠移植瘤模型;观察新城疫病毒(Newcastledisease virus,NDV)对体内肿瘤的生长抑制作用及免疫调节作用;研究NDV在Hu-PBL-SCID小鼠体内移植瘤环境中诱导肿瘤细胞凋亡及凋亡相关蛋白的表达情况;比较NDV对食管癌细胞的选择性杀伤作用及体内应用的高效性、安全性及可行性。为将NDV应用为抗肿瘤疫苗研究及临床实验提供科学的数据。
方法:
1.密度梯度离心法分离人外周血淋巴细胞(human peripheral bloodlvmohocytes,PBL),每只SCID小鼠接受腹腔内注射2×107个PBL,建立人免疫系统;免疫比浊法检测SCID小鼠外周血人IgG含量。
2.用含10％胎牛血清的RPMI1640培养基常规传代培养人食管癌Eca109细胞株。生物倒置显微镜观察培养过程,将对数生长期细胞制成5×107/ml悬液。
3抽取0.1ml配制好的食管癌Eca109细胞悬液,在SCID小鼠右腿内侧皮下注射,每只小鼠设1个皮下接种点,接种约5×106个食管癌对数生长期细胞。
4.成功建立Hu-PBL-SCID小鼠食管癌移植瘤模型,对其免疫学特性进行检测。将Hu-PBL-SCID小鼠食管癌移植瘤模型分组为单纯注射PBS的Eca109-PBS组、NDV治疗的Eca109-NDV组、5-FU治疗的Eca109-5FU组和空白组即Eca109-Free组。
5.对各组小鼠的治疗进行观察,28天处死小鼠,监测其体重、肿瘤体积,称量瘤重、脾重,并计算抑瘤率和脾脏指数,进行毒性评价;取SCID小鼠肿瘤组织、胸腺和脾脏,固定、切片,HE染色,病理观察分析:免疫组化检测Bax、Bcl-2蛋白表达情况;提取Hu-PBL-SCID小鼠肿瘤组织的DNA进行DNA-ladder实验,检测细胞凋亡,探讨NDV在Hu-PBL-SCID小鼠模型体内杀伤食管癌细胞的抗肿瘤机制。
结果:
成功建立Hu-PBL-SCID小鼠食管癌移植瘤模型,并进行了长期的传代与观察,同时对其免疫学特性进行了检测。
1.用免疫比浊法检测SCID小鼠外周血人IgG含量,Eca109-PBS组、Eca109-NDV组和Eca109-5FU组均比Eca109-Free组明显增高,有显著性差异(p＜0.05),表明人外周血淋巴细胞SCID小鼠体内移植及人免疫建立成功。
2.白细胞计数结果显示Eca109-NDV组和Eca109-PBS组相比无显著性差异(p＞0.05),Eca109-5FU组和Eca109-PBS组比较,差异具有统计学意义(P＜0.05)。
3.计算抑瘤率,Eca109-NDV组和Eca,109-5FU组的抑瘤率均大于30%,与Eca109-PBS组相比有显著性差异(p＜0.05),表明Eca109-NDV组和Eca109-5FU组SCID小鼠肿瘤生长均受到了抑制。
4.Eca109-NDV组治疗前后SCID小鼠体重稍有下降,Eca109-5FU组治疗前后SCID鼠体重明显下降。
5.Eca109-NDV组和Eca109-PBS组脾脏质量和脾指数比较无显著性差异(p＞0.05),Eca109-5FU组和Eca109-PBS组比较有显著性差异(p＜0.05)。
6.病理切片HE染色,镜下观察可见,Eca109-PBS组肿瘤细胞个体较完整,死亡区域少,范围较小,细胞大小均匀,胞核密集,染色清晰,核膜完整,可见核仁,胞浆清亮、胞质边界不明显,细胞分裂相多;Eca109-NDV组肿瘤细胞可见成片状死亡区域,范围较大,整体的形态模糊,核大小不等、核固缩明显,核仁消失,核膜溶解,胞浆不清亮,胞质边界不清,细胞分裂相较少,细胞滞长;Eca109-5FU组肿瘤细胞死亡范围较大,亦见大量成片状死亡区域,核大小不等,核固缩,胞浆较多不清亮,颜色较浅,胞质界限模糊。Eca109-NDV组和Eca109-5FU组均显示肿瘤细胞大量死亡。
7.各组SCID小鼠的胸腺、脾脏组织病理切片,HE染色结果观察均未发现有明显的病理改变。
8.免疫组化Bax、Bcl-2蛋白表达结果,Eca109-NDV组中Bax的表达高于Eca109-PBS组,差别具有统计学意义(p＜0.05),Ecal09-NDV组Bcl-2的表达与Eca109-PBS组相比无显著性差异(p＞0.05)。
9.琼脂糖凝胶电泳DNA-ladder实验显示Eca109-NDV组肿瘤组织中提取的DNA片段降解,表现为梯形电泳条带,提示了食管癌Eca109细胞凋亡。
结论:
1.成功建立了Hu-PBL-SCID小鼠食管癌移植瘤模型,SCID小鼠可以用于人类食管癌肿瘤生长的实验研究。
2.新城疫病毒对Hu-PBL-SCID小鼠食管癌移植瘤有明显的抑制作用。
3.新城疫病毒在SCID小鼠体内诱导Eca109细胞凋亡。
4.新城疫病毒可上调Bax蛋白的表达。
5.新城疫病毒在Hu-PBL-SCID小鼠食管癌移植瘤治疗中的副作用小于5-FU,表明其安全有效。