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反硝化菌是指可以在缺氧条件下把硝酸盐(NO3-)、亚硝酸盐(NO2-)中的氮(N)通过一系列中间产物(NO、N2O)还原为氮气分子(N2)的微生物。具有反硝化功能的细菌分布非常广泛,与系统分化无关。
在前人评价反硝化功能基因引物的基础之上,本论文的目的即建立应用功能基因研究生物反应器中反硝化菌群结构的分子生态学方法,并应用于实际反应器反硝化群落多样性和丰度研究中。垃圾填埋和污水处理,作为两个典型的人工生态系统,其共同的目标之一就是脱氮,反硝化作用是脱氮的重要过程,但到目前为止,很少研究关注生物反应器中反硝化作用的执行者,对反硝化菌群的多样性及丰度研究很不系统。本论文选择垃圾填埋模拟柱、复合生物膜.活性污泥反应器及自养、异养、自异养联合反硝化反应器作为研究对象,利用亚硝酸还原酶基因(nirK和nirS)为标记,以PCR-DGGE、克隆和Real-time PCR为研究手段,考察在不同系统中反硝化菌群的多样性和丰度变化,并评估系统条件对群落结构的影响。
研究主要结论如下:
1)反硝化细菌普遍存在于垃圾及污水中,主要是由α-、β-和γ-变形菌纲细菌组成。其中,nirK-反硝化菌主要类群为α-变形菌纲的根瘤菌目(Rhizobiales)；nirS-反硝化菌最主要的类群为β-变形菌纲中的红环菌目(Rhodocyclales)、伯克氏菌目(Burkholderiales)及γ-变形菌纲中的假单胞菌目(Pseudomonadales)。利用功能基因研究手段,不少未与已知序列聚类上的新的反硝化细菌也同时被发现。
2)反硝化菌群结构主要由各种环境因子决定:从基因水平上看,污泥中的电子供体对nirS-,nirK-反硝化群落有重要影响；细菌生长方式(生物膜和活性污泥)对反硝化菌群结构也有重要意义；同时发现垃圾年龄对nirK-反硝化群落结构影响很大。
3)Real-time PCR结果显示,老龄垃圾的nirS-反硝化菌丰度高于nirK-反硝化菌,新鲜垃圾结果正好相反。而在污水中,nirS-反硝化菌丰度均高于nirK-反硝化菌,这暗示了nirS-反硝化菌在反硝化过程中的重要地位。
4)与前人研究结果相似,属于nirS-反硝化细菌的固氮弓菌属和陶厄氏菌属细菌是异养反硝化过程中的优势类群；同时首次发现固氮弓菌属细菌同样也是自养及自异养联合反硝化过程中的优势类群,这说明固氮弓菌属细菌可能既包括自养菌也包括异养菌。这为自、异养反硝化菌可以共存提供了直接的证据。
综上所述,本论文结果为生物反应器中的反硝化过程研究提供了基础数据,分子生态学方法在研究环境样品中反硝化群落结构上具有明显优势,并有待深入。为了更好的理解反硝化菌群生态学,群落功能方面的研究还需进一步发展,而更多分离纯化的反硝化细菌也将为复杂系统中的反硝化群落研究提供分子基础。