紫心甘薯转录因子IbWD40的基因克隆与表达分析

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转录因子可激活植物次生代谢合成途径中多个基因的协同表达,从而有效启动次生代谢过程,在植物次生代谢的转录水平调控方面具有十分重要的作用。因此,转录因子研究为揭示植物次生代谢调控机制提供了重要途径,转录因子基因工程可为植物的遗传改良提供有效手段。WD40蛋白是植物转录因子家族之一,通过保守的、重复的WD基元介导蛋白之间的互作,调控花色素苷生物合成途径中一系列基因的表达。紫心甘薯(Ipomoea batatas(L.)Lam.)在块根中大量合成花色素苷(anthocyanin),因其富含花色素苷的部位深埋地下而具有一定的特殊性,是否其花色素苷的合成和调控模式也具有特殊性是一个值得探讨的科学问题。本项研究针对紫心甘薯在理论研究中试材的独特性和应用上的巨大潜力,以此作为研究试材,开展了转录因子IbWD40的基因克隆、IbWD40蛋白的亚细胞定位以及IbWD40基因的表达特性等方面的研究,获得如下研究结果:  1.从紫心甘薯品种“山川紫”中克隆得到了IbWD40基因的全长cDNA序列,其长度为1427bp,包括一段长1032bp完整的开放阅读框,编码343个氨基酸,并将该基因在GeneBank中进行了登录,其登录号为:JQ955738。预测的IbWD40蛋白分子量为38.1kDa,等电点为4.97;其二级结构由9.62%的α-螺旋、53.06%的无规卷曲、34.11%的延伸链,以及3.21%的β-转角所组成。蛋白三级结构的预测结果表明,IbWD40蛋白具有WD40蛋白家族典型的β-propeller式结构。通过氨基酸多重比对和进化树分析表明IbWD40是植物WD40蛋白家族的成员之一。  2.在不同的甘薯品种或品系(A5、山川紫和禺北白)的基因组中,IbWD40基因均不存在内含子,IbWD40基因ORF区氨基酸序列没有发生变异。  3.构建了用于IbWD40蛋白亚细胞定位分析的pB-IbWD40-EGFP真核表达载体,并通过农杆菌LBA4404介导转化洋葱表皮细胞,共培养18h后,在荧光显微镜下观察发现IbWD40蛋白在细胞膜、细胞质和细胞核中均有存在。  4.采用实时荧光定量PCR技术对着色特征不同的甘薯块根中IbWD40基因的表达特征的分析结果表明,IbWD40基因的表达水平与花色素苷含量的变化趋势一致,并且与花色素苷合成途径中的合成酶基因IbCHS、IbCHI、IbF3H、IbF3’H、IbDFRIbANS和IbUF3GT的表达水平的变化趋势基本相同。初步证明,IbWD40基因是通过调控花色素苷合成途径中一系列合成酶基因的表达,进而影响紫心甘薯中花色素苷的积累。  5.构建了pCambial300-221-Myc+Ib WD40真核超表达载体,并将其转化到农杆菌EHA105中,这为IbWD40基因的遗传转化及其功能分析奠定了基础。
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