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褪黑素对大鼠视网膜神经节细胞甘氨酸电流的调制作用褪黑素(Melatonin，MEL)可由多种组织器官合成和分泌，广泛分布于中枢及周围组织，其分子式为C13H16N2O2，化学名称为5.甲氧基-N-乙酰色胺，参与多种生理功能的调节，包括睡眠与觉醒、免疫、昼夜节律、体温等等。它通过与特异性MEL受体结合发挥作用。目前已纯化的脊椎动物的MEL受体主要分为三种：MT1，MT2和MT3受体。虽然对MT3受体的特性还不甚了解，但MT1和MT2受体均已证实为G蛋白耦联受体，激活这两种受体可经G蛋白引起一系列第二信使级联反应，例如cAMP依赖性蛋白激酶(cAMP-dependent proteinkinase，PKA)、cGMP依赖性蛋白激酶(cGMP-dependent protein kinase，PKG)、蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)等参与的信号转导。
在脊椎动物视网膜，MEL，可由光感受器独立合成及释放，并以旁分泌的方式到达视网膜各级神经元发挥神经调制作用。已有研究工作证实，视网膜多种神经元都表达特异性MEL受体，包括位于内层视网膜的无长突细胞(amacrine cell，AC)、内网层(inner plexiform layer，IPL，)以及神经节细胞。在本工作中，我们采用免疫细胞化学染色、全细胞膜片钳记录，结合快速溶液切换装置(RSC-100)和钙成像技术，研究了MEL对大鼠视网膜神经节细胞(retinal ganglion cell，RGC)的甘氨酸受体活动的调制。
荧光金逆行标记RGC结合免疫细胞化学染色显示，大部分RGC均表达MT2受体，所有RGC都不表达MTl受体。
MEL在部分RGC(33％)明显增大由士的宁敏感的甘氨酸受体介导的电流，并具有时间依赖性，随孵育时间的延长，增大作用越来越明显，在孵育8-10 min左右时作用最大。MT2受体特异性拮抗剂4-P-PDOT 阻断MEL的增大作用，提示MEL增大甘氨酸电流由MT2受体介导。我们的研究集中在这些RGC上。胞内施加G蛋白抑制剂GDP-β-S可阻断MEL的作用，提示G蛋白介导了MT2受体激活后的胞内信号转导过程。cAMP和cGMP拟似物8.Br-cAMP和8-Br-cGMP对甘氨酸电流本身均无明显影响，给予PKA抑制剂H-89或PKG抑制剂KT5823也不能阻断MEt，增大甘氨酸电流的作用，提示cAMP及cGMP信号通路与MEL增大甘氨酸电流无关。另一方面，磷脂酰胆碱特异性磷脂酶C(phosphatidylcholine-specific phospholipase C，PC-PLC)抑制剂D609减小甘氨酸电流，预孵育D609可以完全阻断MEL的作用，表明PC-PLC通路参与MEL对甘氨酸电流的调制作用。
我们进一步探讨了PKC信号通路是否参与了MEL的作用。PKC激活物PMA能时间依赖性地增大甘氨酸电流，与MEL类似。当甘氨酸电流被MEL增大后，再孵育PMA不能再增大甘氨酸电流。另一方面，如果单独用PKC抑制剂Bis IV孵育可减小甘氨酸电流，这一作用与MEL对甘氨酸电流的作用正好相反。而在BisⅣ孵育的情况下，MEL增大甘氨酸电流的效应被阻断。上述结果强烈提示，PKC通路的激活作为PLC激活的后续作用，可能是MEL增大甘氨酸电流的重要环节。
目前为止，PKC分为两种亚型，一种是钙依赖性的，另一种是钙非依赖性的。在本实验中，胞内外无钙环境对MEL的作用无明显影响，提示参与MEL，调节作用的PKC属于钙非依赖性的。进一步的钙成像实验也证实，孵育MEL对大鼠视网膜RGC的胞内钙离子浓度(intracellular calcium concentration，[ca2+]i)无明显影响，这也为钙离子不参与MEL增大甘氨酸电流的作用提供了部分依据。
本论文的结果证实，MEL通过激活RGC上的MT2受体增大甘氨酸电流，其胞内机制可能涉及PC-PLC引起的相关反应。由于甘氨酸受体的活动在RGC感受野的形成和调节中起重要作用，因此MEL可能通过对RGC上甘氨酸电流的影响实现对大鼠内层视网膜光信号整合过程的调制。此外，细胞内PKC信号通路参与调节RGC甘氨酸电流，这也提示其他与PKC通路有关的神经递质有可能参与对RGC功能的调制。