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利用体外肿瘤细胞模型进行活性筛选是发现抗肿瘤药物的重要途径,本论文利用MTT法抗肿瘤药物筛选细胞模型,对植物和微生物来源的天然产物或精制组分进行了体外抗肿瘤活性测定,完成了3514个样品的筛选,发现了多个具有显著体外抗肿瘤活性及选择性杀伤的样品,为深入研究活性化合物的作用机理以及成药性评价,获得抗肿瘤药物先导分子奠定了基础。
毛萼乙素(Eriocalyxin B,EriB)是从疏花毛萼香茶菜中分离提取获得的具有显著体内外抗肿瘤活性的化合物,能够显著抑制NF-kappaB信号通路活性,但其具体的作用靶点及机制并不明确,本研究论文和化学合成团组合作,应用荧光素及生物素标记的毛萼乙素探针对其抗肿瘤作用靶点进行了探究。
首先利用MTT法筛选出与EriB体外抗肿瘤活性相当的毛萼乙素荧光分子探针(EriB-F),细胞内定位实验发现EriB-F在肿瘤细胞质与细胞核均有分布,并随着处理时间延长在细胞核内聚集,处理3hrs后在细胞核内观察到明显的探针分子荧光。
将EriB-F分别与细胞质和细胞核组分孵育结合发现EriB-F与细胞质和细胞核组分均有结合,其结合蛋白的分子量约为50kD。加入DTT(25mmol/L)预处理后EriB-F与细胞质和细胞核组分的结合被抑制,提示:EriB-F通过巯基与其靶蛋白结合。
我们进一步用毛萼乙素的生物素分子探针(EriB-B)通过pull-down实验对其结合的蛋白身份进行了探讨,液质联用检测结果显示其结合蛋白为微管蛋白Tubulin-B,然而进一步的实验结果表明EriB对于微管蛋白的聚集及细胞周期G2/M期的干扰作用非常微弱,由此推断微管不是其发挥抗肿瘤活性的真正功能靶蛋白。
虚拟对接数据提示毛萼乙素可能通过α,β-不饱和酮基团与P50蛋白的Cys-62结合,从而干扰P50蛋白与DNA的结合。因此我们检测了EriB-F与体外表达纯化的GST-p50的结合,结果发现EriB-F的确能够与p50特异结合。利用siRNA对p50蛋白的表达进行干扰后,EriB的体外抗肿瘤活性明显降低(IC50由2.04gμmol/L升至7.3μmol/L),而过表达p50蛋白后IC50降低至0.32gmol/L,提示毛萼乙素的确通过p50蛋白发挥其抗肿瘤活性。由于p50与p65形成二聚体并转位入核是激活NF-kappaB信号通路靶基因表达的必要条件,我们利用免疫组织化学技术以及免疫共沉淀实验进行了毛萼乙素是否干扰p50与p65结合以及转位的检测,结果显示EriB对于NF-κB的核转位及复合物的形成都无明显影响,以上结果提示毛萼乙素可能通过干扰p50/p65蛋白复合体与DNA的结合,从而抑制了NF-kappaB信号通路靶基因的表达发挥其抗肿瘤活性。
为了验证毛萼乙素与p50蛋白的结合机制,我们成功构建了p50突变体(Cys62 Ser及Cys119Ser)表达载体并利用体外蛋白表达体系表达获得了P50突变蛋白,目前正在进行纯化以进一步检测与EriB-F的体外结合。此外,流式细胞技术检测发现p50突变蛋白(Cys62Ser)能够显著地抑制EriB诱导的细胞凋亡。