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褶皱假丝酵母脂肪酶LIP1(Candida Rugosa Lipase 1,CRL1)是一个兼具水解、转酯、酯化等活力的多功能脂肪酶,同时还拥有着与其他七种同工酶相比更高的表达量,因此现已被广泛地应用于生物医药(手性拆分)、食品、生物柴油等多个领域中。但CRL1作为一种常温酶,热稳定性欠佳,这一不足严重制约了其在工业条件下更进一步的应用。为此,本研究采用多种计算机辅助的理性设计方法,结合定点突变技术对CRL1进行热稳定性改造,筛选获得热稳定性改良且具有更强工业适应性的脂肪酶催化剂。主要的研究工作及结果摘要如下:1、以全基因序列密码子优化后的CRL1基因为原初基因,构建N端含有6×Histag的毕赤酵母表达载体pPICZα-N6×His-CRL1,并电转至毕赤酵母GS115中实现分泌表达。随后,镍柱纯化诱导表达的目的蛋白CRL1,并对纯化后的重组脂肪酶CRL1进行了相关酶学性质表征,为后续重要参数的测定及突变体蛋白的筛选研究奠定基础。结果表明重组CRL1的最适温度为40°C,50°C下的半衰期仅为4 min,最适pH与最适底物分别为pH 8.5和对硝基苯酚丁酸酯(C4)。2、综合运用Fold X、Rosetta ddG of mutation和I-Mutant 2.0这三种计算机辅助设计软件进行理性设计,同时对CRL1的活性中心进行分析、筛选,排除会影响CRL1催化特性的功能位点,最终获得13个可以潜在提高重组CRL1热稳定性的突变位点。3、分别构建并表达上述13种CRL1的热稳定突变子,通过对比研究13个突变酶与原初重组酶相应的Tm值,从中筛选获得一株热稳定性显著提高的突变子D457F,其Tm值较原初重组酶CRL1提高了9.4°C。通过对D457F突变子进行其他热稳定性相关酶学性质的测定,发现该突变体蛋白最适温度与50°C下的半衰期较重组CRL1分别提高了10°C和6.5倍,但酶的比活力相差不大,表明457号位点氨基酸残基的替换对酶蛋白的活性影响较小。4、已知α-螺旋是蛋白质二级结构中最为稳定的一种结构,其稳定性在一定程度上影响着整个蛋白质的稳定性。通过SWISS-MODEL的同源建模功能对D457F突变子进行空间结构的预测,发现突变体蛋白中457号位点所在的α-螺旋空间结构延长,同时疏水性氨基酸的引入加强了该螺旋内部的疏水作用,使得α-螺旋变得更为稳定。此外,芳香族氨基酸Phe的引入使得其庞大的侧链恰好填充了Asp由于侧链基团短小而留下的空隙,增强了结构上的刚性从而稳定了蛋白质的结构。