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生物传感涉及生物、化学、材料、物理、医学等多学科领域。它是一种灵敏的、分子水平上的快速、微量的分析检测方法。作为生物传感器的重要分支,电化学生物传感器具有诸多优势,如简单、灵敏、易于获得生物分子本身或反应体系的电子传递过程,因而具有潜在、广泛的应用前景。然而,一些生物分子不具有电活性反应中心,无法对其进行直接检测。电活性标记物的引入,使那些本身不具有电活性或在电极表面电子传递速率较慢的生物分子(如DNA或蛋白质)的检测成为可能。同时,纳米粒子的引入可显著提高电化学方法的灵敏度。除电化学传感器外,表面等离子体激元共振(SPR)光谱传感器也是一种十分灵敏的生物传感器。SPR传感器可对基底表面极小的厚度及折射率变化产生灵敏的信号响应。目前,SPR传感器已被广泛应用于监测诸如DNA杂交、DNA/蛋白质结合以及蛋白质/蛋白质相互作用等生命过程。基于上述考虑,本论文进行了如下研究:
一、采用巯基特异性试剂N-(2-乙基-二茂铁)马来酰亚胺(Fc—Mi)对表面固定的极微量的多肽与靶点DNA进行了检测。所研究的多肽包括含有一个半胱氨酸残基的谷胱甘肽(还原型与氧化型)以及含三个半胱氨酸残基的六肽。采用循环伏安法对上述多肽分子中被Fc-Mi标记的半胱氨酸残基进行了定量。结果表明:Fc-Mi电化学信号的大小与多肽中半胱氨酸残基的数量成正比。该方法对靶点DNA的检测具有极高的序列特异性,可区分单碱基错配与四碱基错配。靶点DNA的最低检测量为10 fmol。
二、采用双功能交联试剂4-马来酰亚胺丁酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(GMBS)将电活性的巯基二茂铁(Fc-SH)基团引入待检测的蛋白质(带正电荷的溶菌酶(Lysozyme)与带负电荷的金属硫蛋白(MT))表面。聚电解质的引入有效地降低了蛋白质在电极表面的非特异性吸附。Fc-SH的电化学信号与通过静电作用吸附在电极表面的蛋白质浓度相关。溶菌酶的检测限可低至0.1 nmol/L。该方法简便、灵敏、重现性较好。
三、采用电活性标记物Fc-Mi检测了由表面固定的一致性双链DNA所捕获的野生型p53蛋白。p53蛋白表面的半胱氨酸残基采用巯基特异性试剂Fc-Mi进行衍生。野生型p53蛋白的键合水平与一致性双链DNA的表面密度及序列相关。通过检测Fc-Mi的电化学信号可以指示p53与一致性双链DNA之间的特异性相互作用。该方法可检测的野生型p53蛋白最低浓度为1.33 nmol/L,对临床上p53蛋白质的检测具有一定的指导作用。
四、通过Fc-SH覆盖的纳米金/抗生蛋白链菌素复合物进行信号放大,采用电化学手段检测了表面固定的野生型p53蛋白。首先将含有一致性位点的双链DNA固定在金电极表面,一致性双链DNA捕获溶液中的野生型p53蛋白,野生型p53蛋白表面的半胱氨酸残基采用biotin-Mi进行衍生,通过生物素-抗生蛋白链菌素的特异性相互作用将Fc-SH引入到电极表面。由于一个纳米金表面可连接多个二茂铁分子,该方法可检测极低浓度的野生型p53蛋白(2.2 pmol/L)。采用上述方法对正常人及癌细胞溶胞液中野生型p53蛋白进行了检测。结果表明,由于癌细胞中p53基因发生了突变,癌细胞中野生型p53蛋白质的浓度大大降低。该方法简便、灵敏、选择性好且不需要p53抗体,具有一定的临床应用价值。
五、采用双通道表面等离子体激元共振技术对癌细胞溶胞液中的野生型以及突变型p53蛋白进行了超灵敏的检测。在其中一个SPR芯片表面固定一致性双链DNA来捕获溶液中的野生型p53蛋白,在另一个SPR芯片表面固定p53单克隆抗体来检测p53蛋白的总量(野生型与突变型之和)。将上述两个芯片的SPR信号进行差减即可反映出癌细胞中p53蛋白的突变水平。该方法采用同种芯片检测癌细胞中野生型以及突变型p53蛋白,克服了传统的酶联免疫吸附分析操作步骤烦琐、且使用酶标抗体的缺陷。此外,同种SPR芯片上野生型与突变型p53蛋白的测定克服了以往不同方法、不同技术检测的不确定性。上述研究将对免标记、高灵敏、高选择性检测癌细胞中p53的变异有所贡献,对临床上癌症早期诊断这一复杂科学问题的研究起到促进作用。