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近年来，人们患眼疾的情况已经日趋严重，现代人长时间对着电视机和计算机，缩短了眼睛休息的时间；加上慢性病如糖尿病、高血压，使视网膜病变、白内障、青光眼等发病率大增。石斛杞片是以叶黄素，β-胡萝卜素及原花青素为主要活性成分的保健品，本课题主要以主要活性成分来制定该产品的检测方法，测定活性成分的含量并进行其安全性毒理实验和缓解视疲劳功能研究。为石斛杞片进行质量控制以及对其他缓解眼视疲劳片研究提供依据具有重要意义。本课题研究内容主要包括两大方面：一、石斛杞片活性成分含量测定研究1、 HPLC对照品替代法同时测定石斛杞片中叶黄素和β-胡萝卜素含量方法的研究方法：60℃中超声3min水解，0.1%BHT的乙腈溶液超声处理30min，定容；色谱柱Thermo-C18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流动相：A甲醇、B水和C四氢呋喃组成，梯度洗脱；流速1.0mL/min；柱温：30℃；检测波长为474nm。结果：叶黄素平均含量值为11.52mg/g，平均回收率为99.55%，RSD=2.47%；β-胡萝卜素平均含量为3.49mg/g，平均回收率为98.92%，RSD=4.69%。本实验首次用对照品替代法测定叶黄素和β-胡萝卜素准确性高，简单方便，具有实际应用价值，可以推广使用。2、 HPLC-MS检测叶黄素以及分析叶黄素电离机理方法：以乙腈为提取溶剂，超声提取叶黄素；色谱柱Thermo Beta Basic-18(150mm×2.1mm，5μm)；流动相：甲醇-0.8%甲酸水（95:5）；流速0.2mL/min；柱温：30℃；离子源ESI(+)；扫描模式MS3；一级扫描采用源内裂解全扫描；二三级扫描采用碎片离子扫描。结果：实验采用源内裂解-全扫描模式，使叶黄素失去甲苯特征碎片离子，再对475.2[M-C7H8]+进行二级三级扫描，得到质荷比为457.2、439.3、362.4的分子离子。首次采用源内裂解后的分子离子作为二三级母离子，为叶黄素定性提供新的思路和数据。3、香草醛-盐酸法测定石斛杞片中原花青素含量研究方法：60%甲醇为提取液，40℃超声提取45min；加入6ml4%香草醛甲醇溶液与3mL浓盐酸，避光反应30min，用甲醇作空白对照，在波长500nm处测定吸光度。结果：香草醛法测定原花青素含量为3.78%，平均回收率为98.8%，RSD为2.86%。4、高效液相色谱法测定石斛杞片中原花青素含量方法：甲醇为提取液，超声提取45min；色谱柱Ultimate ColumnTM C18（4.6mm×250mm，5μm）；流动相：乙腈-水（5:95，v/v）；流速：1.0mL/min；柱温：25℃；检测波长：280nm；进样量：10μL。结果：高效液相色谱法测定原花青素平均含量为38.1mg/g，平均回收率为98.9%，RSD为3.40%。二、石斛杞片安全性实验及缓解视疲劳功能试验研究1、石斛杞片安全性实验研究方法：30天喂养实验（观察动物的一般形态、动物体重变化与食物利用率差异、大鼠血常规检查结果、血清生化检验结果、对大鼠脏体比的影响、对大鼠脏体比的影响）；急性毒性实验；Ames实验；小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验；小鼠精子畸变试验。结果：说明该产品无毒性，无致突变性。2、石斛杞片缓解视疲劳功能试验研究方法：120名志愿者采用随机双盲法分成对照组和样品组，样品组食用受试物，对照组食用安慰剂，均为2粒/次，3次/天，连续服用60d。结果：受试物试验组比较与对照组组间比较，症状改善且症状总积分差异有显著性（P<0.05）以及试验组自身比较或试验组与对照组组间比较，明视持久度差异有显著性，且平均明视持久度提高大于等于10%，判断此受试物具有缓解视疲劳功能。