【摘 要】
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目的:观察体内和体外缺血缺氧性星形胶质细胞自噬/溶酶体途径的激活,探讨自噬在缺血缺氧性星形胶质细胞死亡中的作用。方法:采用大鼠永久性大脑中动脉阻塞(permanent middle
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目的:观察体内和体外缺血缺氧性星形胶质细胞自噬/溶酶体途径的激活,探讨自噬在缺血缺氧性星形胶质细胞死亡中的作用。方法:采用大鼠永久性大脑中动脉阻塞(permanent middle cerebral artery occlusion, pMCAO)方法,建立脑缺血的大鼠模型;采用原代培养的新生鼠皮层星形胶质细胞氧糖剥夺(oxygen-glucose deprivation,OGD)方法,建立脑缺血的细胞模型。利用透射电镜和MDC染色法观察星形胶质细胞中自噬和溶酶体的激活,免疫荧光法和Western Blot法检测体内和体外缺血缺氧对星形胶质细胞中自噬、溶酶体和凋亡相关蛋白表达的影响,以及抑制自噬对这些蛋白表达的影响。LDH法检测抑制自噬对星形胶质细胞乳酸脱氢酶漏出率的影响。结果:透射电镜显示,大脑中动脉阻塞1 h-3 h可见大鼠大脑缺血皮层星形胶质细胞胞浆内浆网扩张,自噬小体形成,线粒体肿胀,6 h溶酶体被激活,24 h见凋亡存在;另一方面,原代培养的星形胶质细胞在OGD 0.5 h-3 h可见胞浆内大量空泡、自噬小泡形成,内浆网扩张,6 h溶酶体被激活,12 h可见星形胶质细胞坏死或者凋亡。MDC染色发现星形胶质细胞OGD 0.5 h后即有大量自噬囊泡出现,并持续至3 h达到高峰。免疫荧光法显示大鼠pMCAO后与对照组相比, LC3的阳性细胞增多;星形胶质细胞OGD后LC3荧光颗粒较对照组多,给予自噬抑制剂3-MA(10 mM)后,LC3荧光强度显著减弱。Western Blot结果显示,星形胶质细胞在OGD 0 h、0.5 h、1 h、3 h、6 h、12 h后,Beclin 1的表达水平在1 h就迅速升高,达到峰值(P<0.01),随后逐渐减弱;LC3的表达水平在短期内迅速增高,3 h达到高峰(P<0.01),6 h表达水平仍较高,但已开始减弱(P<0.01);cathepsin B和LAMP 2的表达水平均在6 h达到高峰(P<0.01);Bcl-2的表达水平在OGD后逐渐降低(P<0.01)。另外Western Blot结果显示,给予3-MA(10 mM)能显著降低星形胶质细胞LC3的表达(P<0.05)。LDH结果显示,3-MA(5、10、20 mM)能降低星形胶质细胞OGD 3 h后LDH的漏出率(P<0.05),且呈一定的剂量依赖性。结论:1.体内和体外缺血缺氧性星形胶质细胞内自噬/溶酶体途径激活,且早于凋亡和细胞坏死前发生。2. 3-MA对缺血缺氧的星形胶质细胞有保护作用,提示自噬/溶酶体途径的过度激活可能促进缺血缺氧性星形胶质细胞的死亡。
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