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背景
对于全球老年男性来说，前列腺癌是最常见的泌尿系统恶性肿瘤，而在我国，该癌症的发病率正逐年快速增长。抗雄激素治疗是临床上常用的方法，相比于化疗，该治疗让患者更具治疗依从性，更小的机体副反应，更小的经济负担，而且疗效值得肯定。但事实证明，绝大部分前列腺癌患者经抗雄激素治疗后呈现出从雄激素依赖性到雄激素非依赖性这一转变过程，对抗雄激素治疗不再有效，最终死于雄激素非依赖性前列腺癌转移，患者的平均生存时间大约为18个月。面对这么严峻的形势，寻求更新、更有效的治疗方法势在必行。
目前，很多学者的研究方向集中在前列腺癌雄激素受体（androgenreceptor,AR）的合成调节，但对于AR的降解代谢以及翻译转录方面仍然涉足甚少，而前列腺癌雄激素受体的反常激活、表达增加、突变、调节因子表达、信号途径都能促进前列腺癌的扩增及进展。AR依赖的前列腺癌中AR水平的下调，包括抑制AR扩增或促进AR降解，都能起到有效的抗肿瘤作用。已有研究证明，大约80%-90%的人体蛋白质通过泛素-蛋白酶体系统(ubiquitin-proteasomesystem,UPS)进行降解，它是细胞内高度特异性和选择性的蛋白质降解途径，剩余的10-20%蛋白质则通过自噬溶酶体途径进行降解。而蛋白泛素化降解过程是可逆的，在蛋白降解的同时，细胞内的去泛素化蛋白酶（deubiquitinatingenzymes,DUBs）也可以进行特异性负向调节。USP14作为一个特异性去泛素化蛋白酶，存在于19S蛋白酶体上，我们课题组前期的研究表明，在AR依赖的前列腺癌中，USP14能稳定并调节AR。
金诺芬（Auranofin,Aur）是一种人工合成的含磷金化合物，具有较强的抗炎作用，目前在临床上用于治疗类风湿性关节炎，抗炎镇痛效果显著，近年来大量研究证实金诺芬在各种肿瘤治疗方面具有良好的临床应用前景，但其具体作用机制尚不清楚。在前期研究中，我们发现金诺芬能够引起肿瘤细胞泛素化蛋白的大量聚集，可以特异性抑制19S蛋白酶体中USP14/UCHL5的活性，但对20S蛋白酶体酶活性无明显抑制，这是国内外迄今为止从临床药物中发现的第一个去泛素化酶抑制剂。本课题拟通过多种手段围绕金诺芬介导的去泛素化酶抑制与其抗前列腺癌作用进行研究，同时明确金诺芬特异性抑制的去泛素化酶，确证金诺芬抗肿瘤的作用机理，为金诺芬的老药新用开发提供新的靶点。
实验方法
1、检测肿瘤细胞活力：采用MTS方法检测细胞存活率，不同浓度的Aur作用于前列腺癌细胞，检测其活力。
2、肿瘤细胞克隆形成试验：特定浓度Aur处理肿瘤细胞，然后通过电子显微镜观察，计数肿瘤细胞的克隆数以及观察细胞集落形成情况。
3、细胞凋亡以及细胞周期测定实验：Aur处理肿瘤细胞后，通过AnnexinV-FITC/Propidiumiodide(PI)双染色标记细胞，然后利用流式细胞术检测细胞周期及细胞凋亡，并用荧光显微镜拍照记录。
4、免疫共沉淀（Co-IP）以及蛋白免疫印迹技术（Westernblot）：检测经Aur处理后前列腺癌细胞中目的蛋白的表达。
5、SiRNA转染技术：利用SiRNA转染技术，沉默USP14和UCHL5RNA后检测前列腺癌细胞的活力。
6、实时荧光定量核酸扩增检测技术（RT-qPCR）：根据试剂盒操作指南操作，待扩增结束后分别检测目的基因，得到其Cq值?
7、裸鼠移植瘤实验：购置BALB/c裸鼠，皮下接种前列腺癌细胞构建裸鼠移植瘤模型，随机分两组（处理组与对照组）,Aur注射给药后，测定对比肿瘤的重量、体积，以及比较两组裸鼠体重的变化。
实验结果
1、Aur抑制PCa细胞的增殖
不同浓度的Aur(0-2μmol/L)处理前列腺癌细胞24h及48h，通过MTS检测发现前列腺癌细胞都有不同程度的增殖抑制，且AR（+）细胞的增殖抑制更为明显。另外，克隆形成实验表明，Aur明显抑制LNCaP细胞的集落形成。利用22RV1前列腺癌细胞株建立裸鼠移植瘤模型两组（处理组与对照组），发现经Aur处理后，处理组肿瘤重量和肿瘤体积低于对照组，且两组裸鼠的体重并不存在统计学上差异。最后在肿瘤组织中，通过免疫组化实验测定相关蛋白的表达情况。结果表明Aur在体内外能抑制PCa细胞的增殖。
2、Aur诱导AR（+）PCa细胞凋亡
Aur作用于22RV1和LNCaP细胞，检测结果显示Annexin-Ⅴ/PI染色的阳性细胞显著增多，并可观察到典型的细胞凋亡形态。Westernblot实验结果显示，22RV1和LNCaP细胞中CC3都显著升高，并且可见PARP切割带。我们还发现Aur在PCa细胞中触发了抗凋亡蛋白Bcl-2的下调，说明Aur能诱导AR（+）PCa细胞凋亡。
3、Aur促使细胞周期停滞
不同浓度Aur（0,0.5,1,2μmol/L）处理22Rv1和LNCaP细胞24小时，细胞周期检测结果显示经Aur处理后，前列腺癌细胞的细胞周期均停滞在G0/G1期。随后利用Westernblot测定相关的细胞周期蛋白，发现经Aur处理后，cyclinD1、CDK4的表达显著下调，但P21的表达则增加，表明Aur可促使PCa细胞周期停滞。
4、Aur诱导PCa细胞的蛋白酶体抑制以及ERS（内质网应激）
不同浓度Aur（0,0.5,1,2μmol/L）处理AR（+）PCa细胞后，通过蛋白免疫印迹技术我们发现Aur可以竞争性结合USP14和UCHL5，并且泛素化蛋白显著增加，表明Aur抑制了UCHL5以及USP14的活性。另外，通过Westernblot我们还发现，同样浓度Aur处理PCa后，与细胞内质网应激有关的P-eIF2α和CHOP表达显著升高。说明Aur诱导的蛋白酶体抑制及内质网应激参与到前列腺癌细胞的凋亡中。
5、Aur下调雄激素受体（AR）的蛋白质水平
用不同浓度Aur（0,0.5,1,2μmol/L）处理22RV1和LNCap细胞，然后通过蛋白免疫印迹检测AR的蛋白水平。我们发现，Aur能引起AR依赖前列腺癌细胞中AR蛋白表达下调。此外，经Aur处理后共聚焦显微镜检测出PCa细胞核与细胞质中AR均有减少，且比例无明显变化，并无蛋白位移。结果表明Aur能够下调AR的蛋白水平。
6、Aur促进雄激素受体蛋白质降解并抑制雄激素受体转录
我们进行了CHX追踪实验，发现经Aur处理的前列腺癌细胞中AR的半衰期明显下降，说明Aur可能通过蛋白降解的方式下调AR的蛋白水平，而且Co-IP实验发现泛素化的AR水平经Aur处理后明显升高，说明Aur引起的AR蛋白水平下调是通过调控AR的泛素化降解实现的。另外，我们利用RT-qPCR检测了经Aur处理的前列腺癌细胞的RNA，结果发现AR和PSA基因（AR的靶基因）均出现下降，说明Aur不仅能促进AR蛋白降解，还能抑制其转录。
结论
Aur可以通过抑制蛋白酶体相关去泛素化酶及阻断雄激素受体有效抗前列腺癌。
对于全球老年男性来说，前列腺癌是最常见的泌尿系统恶性肿瘤，而在我国，该癌症的发病率正逐年快速增长。抗雄激素治疗是临床上常用的方法，相比于化疗，该治疗让患者更具治疗依从性，更小的机体副反应，更小的经济负担，而且疗效值得肯定。但事实证明，绝大部分前列腺癌患者经抗雄激素治疗后呈现出从雄激素依赖性到雄激素非依赖性这一转变过程，对抗雄激素治疗不再有效，最终死于雄激素非依赖性前列腺癌转移，患者的平均生存时间大约为18个月。面对这么严峻的形势，寻求更新、更有效的治疗方法势在必行。
目前，很多学者的研究方向集中在前列腺癌雄激素受体（androgenreceptor,AR）的合成调节，但对于AR的降解代谢以及翻译转录方面仍然涉足甚少，而前列腺癌雄激素受体的反常激活、表达增加、突变、调节因子表达、信号途径都能促进前列腺癌的扩增及进展。AR依赖的前列腺癌中AR水平的下调，包括抑制AR扩增或促进AR降解，都能起到有效的抗肿瘤作用。已有研究证明，大约80%-90%的人体蛋白质通过泛素-蛋白酶体系统(ubiquitin-proteasomesystem,UPS)进行降解，它是细胞内高度特异性和选择性的蛋白质降解途径，剩余的10-20%蛋白质则通过自噬溶酶体途径进行降解。而蛋白泛素化降解过程是可逆的，在蛋白降解的同时，细胞内的去泛素化蛋白酶（deubiquitinatingenzymes,DUBs）也可以进行特异性负向调节。USP14作为一个特异性去泛素化蛋白酶，存在于19S蛋白酶体上，我们课题组前期的研究表明，在AR依赖的前列腺癌中，USP14能稳定并调节AR。
金诺芬（Auranofin,Aur）是一种人工合成的含磷金化合物，具有较强的抗炎作用，目前在临床上用于治疗类风湿性关节炎，抗炎镇痛效果显著，近年来大量研究证实金诺芬在各种肿瘤治疗方面具有良好的临床应用前景，但其具体作用机制尚不清楚。在前期研究中，我们发现金诺芬能够引起肿瘤细胞泛素化蛋白的大量聚集，可以特异性抑制19S蛋白酶体中USP14/UCHL5的活性，但对20S蛋白酶体酶活性无明显抑制，这是国内外迄今为止从临床药物中发现的第一个去泛素化酶抑制剂。本课题拟通过多种手段围绕金诺芬介导的去泛素化酶抑制与其抗前列腺癌作用进行研究，同时明确金诺芬特异性抑制的去泛素化酶，确证金诺芬抗肿瘤的作用机理，为金诺芬的老药新用开发提供新的靶点。
实验方法
1、检测肿瘤细胞活力：采用MTS方法检测细胞存活率，不同浓度的Aur作用于前列腺癌细胞，检测其活力。
2、肿瘤细胞克隆形成试验：特定浓度Aur处理肿瘤细胞，然后通过电子显微镜观察，计数肿瘤细胞的克隆数以及观察细胞集落形成情况。
3、细胞凋亡以及细胞周期测定实验：Aur处理肿瘤细胞后，通过AnnexinV-FITC/Propidiumiodide(PI)双染色标记细胞，然后利用流式细胞术检测细胞周期及细胞凋亡，并用荧光显微镜拍照记录。
4、免疫共沉淀（Co-IP）以及蛋白免疫印迹技术（Westernblot）：检测经Aur处理后前列腺癌细胞中目的蛋白的表达。
5、SiRNA转染技术：利用SiRNA转染技术，沉默USP14和UCHL5RNA后检测前列腺癌细胞的活力。
6、实时荧光定量核酸扩增检测技术（RT-qPCR）：根据试剂盒操作指南操作，待扩增结束后分别检测目的基因，得到其Cq值?
7、裸鼠移植瘤实验：购置BALB/c裸鼠，皮下接种前列腺癌细胞构建裸鼠移植瘤模型，随机分两组（处理组与对照组）,Aur注射给药后，测定对比肿瘤的重量、体积，以及比较两组裸鼠体重的变化。
实验结果
1、Aur抑制PCa细胞的增殖
不同浓度的Aur(0-2μmol/L)处理前列腺癌细胞24h及48h，通过MTS检测发现前列腺癌细胞都有不同程度的增殖抑制，且AR（+）细胞的增殖抑制更为明显。另外，克隆形成实验表明，Aur明显抑制LNCaP细胞的集落形成。利用22RV1前列腺癌细胞株建立裸鼠移植瘤模型两组（处理组与对照组），发现经Aur处理后，处理组肿瘤重量和肿瘤体积低于对照组，且两组裸鼠的体重并不存在统计学上差异。最后在肿瘤组织中，通过免疫组化实验测定相关蛋白的表达情况。结果表明Aur在体内外能抑制PCa细胞的增殖。
2、Aur诱导AR（+）PCa细胞凋亡
Aur作用于22RV1和LNCaP细胞，检测结果显示Annexin-Ⅴ/PI染色的阳性细胞显著增多，并可观察到典型的细胞凋亡形态。Westernblot实验结果显示，22RV1和LNCaP细胞中CC3都显著升高，并且可见PARP切割带。我们还发现Aur在PCa细胞中触发了抗凋亡蛋白Bcl-2的下调，说明Aur能诱导AR（+）PCa细胞凋亡。
3、Aur促使细胞周期停滞
不同浓度Aur（0,0.5,1,2μmol/L）处理22Rv1和LNCaP细胞24小时，细胞周期检测结果显示经Aur处理后，前列腺癌细胞的细胞周期均停滞在G0/G1期。随后利用Westernblot测定相关的细胞周期蛋白，发现经Aur处理后，cyclinD1、CDK4的表达显著下调，但P21的表达则增加，表明Aur可促使PCa细胞周期停滞。
4、Aur诱导PCa细胞的蛋白酶体抑制以及ERS（内质网应激）
不同浓度Aur（0,0.5,1,2μmol/L）处理AR（+）PCa细胞后，通过蛋白免疫印迹技术我们发现Aur可以竞争性结合USP14和UCHL5，并且泛素化蛋白显著增加，表明Aur抑制了UCHL5以及USP14的活性。另外，通过Westernblot我们还发现，同样浓度Aur处理PCa后，与细胞内质网应激有关的P-eIF2α和CHOP表达显著升高。说明Aur诱导的蛋白酶体抑制及内质网应激参与到前列腺癌细胞的凋亡中。
5、Aur下调雄激素受体（AR）的蛋白质水平
用不同浓度Aur（0,0.5,1,2μmol/L）处理22RV1和LNCap细胞，然后通过蛋白免疫印迹检测AR的蛋白水平。我们发现，Aur能引起AR依赖前列腺癌细胞中AR蛋白表达下调。此外，经Aur处理后共聚焦显微镜检测出PCa细胞核与细胞质中AR均有减少，且比例无明显变化，并无蛋白位移。结果表明Aur能够下调AR的蛋白水平。
6、Aur促进雄激素受体蛋白质降解并抑制雄激素受体转录
我们进行了CHX追踪实验，发现经Aur处理的前列腺癌细胞中AR的半衰期明显下降，说明Aur可能通过蛋白降解的方式下调AR的蛋白水平，而且Co-IP实验发现泛素化的AR水平经Aur处理后明显升高，说明Aur引起的AR蛋白水平下调是通过调控AR的泛素化降解实现的。另外，我们利用RT-qPCR检测了经Aur处理的前列腺癌细胞的RNA，结果发现AR和PSA基因（AR的靶基因）均出现下降，说明Aur不仅能促进AR蛋白降解，还能抑制其转录。
结论
Aur可以通过抑制蛋白酶体相关去泛素化酶及阻断雄激素受体有效抗前列腺癌。