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研究背景：
极性是真核细胞的基本生物学特征。细胞极性(cen polarity)对正常的细胞分化、细胞迁移、细胞质分裂以及组织、器官的形成等众多生物学过程起着关键性的作用。细胞极性是指细胞为了行使特殊的生理功能或产生定向的分化,在胞内的信号分子不对称分布致使细胞在表型上产生不对称性。具体表现在细胞形状、细胞内蛋白质、脂质等物质不对称分布,细胞结构发生重构。极性细胞特征性变化是细胞内必须的细胞骨架分子在细胞前极形成一个富含丝状肌动蛋白的片状伪足,而在后极形成尾足:细胞极化参与诸如营养物质获取、酵母繁殖、伤口修复、轴突生长、血管发生、胚胎发育、原生动物多细胞结构的形成和机体发育过程中细胞的迁移功能,所以目前将极性和生长、发育等并列为细胞的基本功能。
中性粒细胞生理学的发挥功能有赖于极性的形成。临床上多种疾病如败血症、哮喘、缺血/再灌注损伤和器官移植产生的排斥反应、类风湿性关节炎及一些由于感染引起的器官衰竭反应都与中性粒细胞极性功能的增强或减弱相关。中性粒细胞是机体遭受外来细菌和其他病原体入侵时机体的第一道防线,而这种作用是建立在中性粒细胞极性和趋化性基础上的。在各种趋化物的作用下,中性粒细胞凭借胞内分子对极化信号的优化和放大,能够准确确定炎症部位并使其自身发生极性改变,最终向炎症部位发生定向移动,而中性粒细胞极性化是其定向迁移的前提条件。
多种分子参与趋化剂刺激导致的中性粒细胞极性化过程,近年来研究胞内Ca2+浓度和分布的变化也涉及其中。中性粒细胞趋化剂甲酰甲硫氨酰.亮氨酰.苯丙氨酸(fMLP)可以通过G蛋白偶联受体进而激活内质网膜上IP3受体从而诱导内质网Ca2+库的释放钙离子。内质网Ca2+库释放可以激活SOCE通路,促进细胞外钙的内流。在中性粒细胞的研究中发现,中性粒细胞质内钙浓度的升高是其活化的必要条件,因而可通过SOC抑制剂来抑制中性粒细胞活性。TRPC可被胞内钙离子浓度激活,被认为是最可能的钙库操纵性钙通道和受体操纵性钙通道的分子基础。但TRPC1作为SOC的主要候选分子是否参与中性粒细胞极性化过程以及在此过程中起何种作用,阻断TRPC1后对中性粒细胞极性化过程以及趋化性有何影响,尚无确切报道。
TRPC1在细胞极性化过程中可能起着重要的作用,而且这种作用可能与胞膜上存在的一类特殊脂质结构-脂筏(Lipid raft)存在密切的关系,其关键功能是它是一个信号的平台。为了进一步理解TRPC1和脂筏的关系,我们观察了mDCD(甲基-β-环糊精,Methyl-β-cyclodextrin)对中性粒细胞极性的影响。mβCD能够清空中性粒细胞胆固醇,破坏脂筏完整性,从而可能影响到极性的形成过程。
由于使中性粒细胞发生极性的各种机制之间的关系复杂又密切,尤其是SOCE机制的主要候选分子TRPC1在极化过程中的作用,以及其与脂筏的相互关系有待于进一步研究与探讨。
目的：
本实验通过使用均一、低浓度的fMLP作用于中性粒细胞建立细胞极性模型。通过观察TRPCI通道蛋白分子的转位；以及应用TRPC通道抑制剂(SK&F96365、2-APB)和破坏脂筏结构的特异药物(mβCD)预处理中性粒细胞进而观察对极性分子F-actin的影响以及对细胞极性的影响,从而探讨TRPC1在中性粒细胞极性化过程中的作用以及和脂筏的关系。
方法
1.采用Dextran沉降法、标准的梯度密度离心和红细胞裂解的方法分离人血中性粒细胞,进行瑞氏.吉姆萨染色和台盼蓝染色分析细胞纯度和细胞活力。
2.应用免疫荧光方法检测聚合F-actin,TRPC1和脂筏在人中性粒细胞内的分布。
3.应用免疫荧光方法检测聚合F-actin,TRPC1和脂筏在dHL-60细胞内的分布。
结果
1.中性粒细胞分离后,对细胞进行台盼蓝染色,细胞的活性大于98％,瑞氏-姬姆萨染色,细胞纯度大于95％。
2.在fMLP诱导的细胞极性过程中TRPC1蛋白分子、F-actin极性分子以及脂筏均发生极性分布；
3.使用TRPC通道阻断剂细胞极性被抑制,极性分子F-actin蛋白不能聚集:
4.在fMLP诱导的细胞极性过程中TRPC1蛋白与脂筏共定位,当破坏脂筏结构时TRPC1和F-actin在细胞膜上均散在并相对均匀分布。脂筏参与细胞极性化过程TRPC1蛋白通过脂筏参与细胞极性化过程。
结论
1 rRPC1是极性分子。
2 TRPC1需要通过转位到脂筏上参与细胞极性的发生。