【摘 要】
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Puma/Bbc3是近年来新发现的一个Bcl-2家族唯BH3域蛋白成员，可由各种p53依赖性和非依赖性刺激活化，对细胞凋亡起着全面调控的作用。为研究puma/bbc3基因高表达对人胃癌SGC-7901
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Puma/Bbc3是近年来新发现的一个Bcl-2家族唯BH3域蛋白成员，可由各种p53依赖性和非依赖性刺激活化，对细胞凋亡起着全面调控的作用。为研究puma/bbc3基因高表达对人胃癌SGC-7901细胞株增殖及凋亡的影响，并探讨其作用机制，采用脂质体介导pEGFP-C1-PUMA瞬时转染SGC-7901细胞，实现外源性puma/bbc3在细胞中高表达后，MTT比色法测定细胞的增殖抑制，HE染色、吖啶橙/溴化乙锭荧光染色、Hoechst 33342荧光染色法检测细胞凋亡的形态学变化，流式细胞仪检测细胞周期和线粒体膜电位的变化，Western blot检测细胞色素c(Cyt c)和凋亡诱导因子(AIF)从线粒体到胞浆的易位情况。结果显示，外源性puma/bbc3基因高表达可使SGC-7901细胞的生长增殖能力降低并诱导凋亡，细胞DNA合成受到抑制，周期阻滞在G0/G1期，线粒体膜电位明显下降，并促使Cyt c、AIF从线粒体进入胞浆。提示puma/bbc3基因高表达可有效抑制人胃癌SGC-7901细胞的增殖，使细胞生长停滞，并诱发细胞凋亡。凋亡机制主要是线粒体途径，与线粒体膜电位降低和Cyt c、AIF从线粒体释放有关。
为获得基因重组的Puma．BH3结构域短肽并检测其生物学活性，将人工合成的编码Puma-BH3肽的DNA片段克隆到质粒pTYB2上，构建出原核表达质粒pTYB2-Puma-BH3，转化大肠杆菌BL-21(DE3)中IPTG诱导表达。表达的融合蛋白经几丁质亲和层析、二硫苏糖醇(DTT)的柱内还原，直接获得可溶性Puma-BH3肽。研究了重组Puma-BH3肽在体外条件下对线粒体活力、线粒体肿胀度以及Cyt c释放的影响。结果表明，获得的可溶性Puma-BH3肽能作用干离体线粒体，引起线粒体活力降低，线粒体肿胀并能诱导Cyt c释放。环孢菌素A对此有一定的抑制作用，提示PUMA-BH3肽对线粒体的上述作用是通过促进通透性转运孔(PTP)开放实现的。经原核表达及纯化，获得了具有促凋亡活性的Puma-BH3肽，为进一步研制控制凋亡过程的药物奠定了基础。
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