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芥菜是我国南方广泛栽植的十字花科蔬菜作物,开花时间的早晚将会影响产品器官的产量与品质。虽然在模式植物拟南芥中已分离出大量与开花相关的基因,但是,在蔬菜作物芥菜上这些同源基因是否具有相似的功能,它们调控芥菜开花时间的分子机制究竟如何,目前并不清楚。迄今为止,有关芥菜AGL24蛋白与SOC1基因之间的作用机制仍未见报道。为了研究芥菜AGL24蛋白与SOC1基因的互作机理,本试验通过酵母单杂交体系和双萤光素酶活性检测系统检测了芥菜SOC1启动子的全长、截短体(含CArG-box基序的3个SOC1小片段)、突变体(CArG-box基序突变后的小片段)分别与AGL24蛋白之间的相互作用,从而筛选SOC1启动子与AGL24蛋白的结合区域。此外还利用农杆菌介导AGL24转化芥菜,从体内验证转基因植株对SOC1基因表达及开花的影响。为深入研究SOC1基因的表达调控提供一定的理论基础。主要试验结果如下:1.芥菜AGL24基因的克隆及生物信息学分析以芥菜茎尖总RNA反转录cDNA第一链作为模板,扩增得到的AGL24基因的cDNA序列为666 bp,预测编码221个氨基酸残基。通过Prot Param软件分析表明AGL24蛋白由20种氨基酸组成,其中Leu和Ser所占比例最高,相对分子质量为24.902 kDa,理论等电点为7.67。2.芥菜SOC1启动子全长与AGL24蛋白相互作用检测筛选抑制重组酵母菌Y1H(pAbAi-SOC1)生长的环酯肽抗生素(Aureobasidin A,简称AbA)的最低浓度,结果表明当AbA浓度为100 ng/m L时,酵母重组菌株Y1H(pAbAi-SOC1)不能生长,由此说明抑制重组酵母菌株Y1H(pAbAi-SOC1)的AbA最低浓度为100 ng/m L。然后将构建好的酵母表达载体pGADT7-AGL24转化到Y1H(pAbAi-SOC1)酵母感受态细胞中,发现二倍体酵母Y1H(SOC1+AGL24)能在sd/-leu/aba100上正常生长,表明芥菜soc1启动子能与agl24蛋白相互作用。同时,构建双萤光素酶表达载体luc-soc1和sk-agl24,通过冷热刺激法转化到农杆菌gv3101(psoup)中。然后将这两种菌液按1:9的比例混合共侵染6片左右真叶的本氏烟,60h后在glomax?-multi+多功能检测仪上检测萤火虫萤光素酶活性和海肾萤光素酶的活性,并计算萤火虫萤光素酶与海肾萤光素酶的比值。结果表明,试验组的比值显著高于阴性对照组的,说明soc1启动子与agl24蛋白在植物细胞内可以互作。3.芥菜soc1启动子的截短体与agl24蛋白相互作用检测为了进一步找出agl24蛋白与soc1启动子结合的关键区域,本试验筛选出抑制重组酵母菌株y1h(pabai-soc1-1)、y1h(pabai-soc1-2)和y1h(pabai-soc1-3)生长的aba最低浓度分别为100ng/ml、150ng/ml和100ng/ml。然后将酵母重组质粒pgadt7-agl24分别转化到y1h(pabai-soc1-1)、y1h(pabai-soc1-2)和y1h(pabai-soc1-3)酵母感受态细胞中。结果发现:只有二倍体酵母菌株y1h(pabai-soc1-2+agl24)能在含有相应aba背景浓度下的培养基sd/-leu/aba150上正常生长,而其他的均不能生长。为了进一步鉴定芥菜soc1启动子截短体与agl24在植物体内的互作情况,本试验分别将soc1启动子的三个截短体与双萤光素酶表达载体pgreenii0800-luc连接,得到重组质粒luc-soc1-1、luc-soc1-2和luc-soc1-3,通过冷热刺激法分别转化农杆菌感受态gv3101(psoup)。然后分别将转有启动子片段的农杆菌菌液和转有agl24蛋白的农杆菌菌液按od600比值1:9混合均匀。再将混匀的菌液分别侵染6片真叶的本氏烟,60h后在glomax?-multi+多功能检测仪上检测萤火虫萤光素酶活性和海肾萤光素酶的活性,并计算萤火虫萤光素酶与海肾萤光素酶的比值。结果表明:所有试验组的比值均显著高于阴性对照组的比值。说明三个截短体soc1-1、soc1-2和soc1-3均能与agl24蛋白在植物细胞内相互作用。4.芥菜soc1的启动子carg-box突变体与agl24相互作用检测为了更进一步分析agl24蛋白是否特异性的结合到soc1启动子截短体上的carg-box基序,本试验提取实验室已构建好的两种soc1启动子突变体片段(carg-box内a-t碱基互换突变及carg-box删除突变体)与酵母表达载体连接的重组质粒,然后将其分别转化酵母感受态菌株y1h。筛选出抑制酵母菌株y1h(pAbAi-SOC1-1E)、Y1H(pAbAi-SOC1-2E)和Y1H(pAbAi-SOC1-3E)生长的AbA最低浓度分别为100 ng/mL、150 ng/mL和200 ng/m L,抑制酵母菌株Y1H(pAbAi-SOC1-1D)、Y1H(pAbAi-SOC1-2D)和Y1H(pAbAi-SOC1-3D)生长的AbA最低浓度分别均为100 ng/m L。然后将酵母重组质粒pGADT7-AGL24分别转化到Y1H(pAbAi-SOC1-1E)、Y1H(pAbAi-SOC1-2E)、Y1H(pAbAi-SOC1-3E)、Y1H(pAbAi-SOC1-1D)、Y1H(pAbAi-SOC1-2D)、Y1H(pAbAi-SOC1-3D)酵母感受态细胞中。结果发现:所有二倍体酵母菌株均不能在含有相应AbA背景浓度下的培养基SD/-Leu/AbA上正常生长。为了进一步确定芥菜SOC1启动子突变体片段与AGL24在植物体内的互作情况,本试验分别将SOC1启动子的6个突变体片段与双萤光素酶表达载体pGreen II0800-LUC连接,得到重组质粒LUC-SOC1-1E、LUC-SOC1-2E、LUC-SOC1-3E、LUC-SOC1-1D、LUC-SOC1-2D、LUC-SOC1-3D。并将重组质粒通过冷热刺激法分别转化重组农杆菌GV3101(pSoup),按OD600的比值1:9将启动子突变体片段与AGL24蛋白混合均匀。然后将混匀的菌液分别侵染6片真叶的本氏烟,60 h后在GloMax?-Multi+多功能检测仪上检测萤火虫萤光素酶活性和海肾萤光素酶的活性,并计算萤火虫萤光素酶与海肾萤光素酶的比值。结果表明:所有试验组的比值与阴性对照组的比值差异不显著。说明SOC1截短体小片段CArG-box内A碱基与T碱基互换或者删除CArG-box后,均不能与AGL24蛋白发生相互作用。以此推断:SOC1与AGL24之间的相互作用会受到CArG-box1、CArG-box2和CArG-box3特异性调控。5.芥菜AGL24转基因表达载体构建及其转化芥菜根据AGL24基因全长序列,并结合植物双元载体pBI121的多克隆位点,设计引物并选用合适的酶切位点。构建表达载体pBI121-AGL24,转化芥菜幼苗下胚轴,在MS培养基上经预培养、侵染、共培养、筛选培养、分化培养等,然后再炼苗移栽,成功获得转AGL24基因的芥菜植株。