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先天畸形或后天疾患（感染、恶性肿瘤、外伤等）常造成膀胱壁的大部分、甚至整体的丧失。临床上现常规利用胃肠道行膀胱替代,从胃到直肠的各段消化道均被人们尝试用于新膀胱或尿流输出道的构建。然而由于胃肠粘膜分泌与吸收等难以克服的因素引起的并发症,增加了患者的痛苦。随着再生医学的兴起,组织工程膀胱替代成为了研究热点。组织工程修复缺损膀胱主要有两种方式:单纯支架修复和种子细胞复合支架修复。单纯生物材料技术经常会由于出现移植物挛缩、移植物不能实现快速血管化和平滑肌再生不良等不利因素,因此在膀胱修复尤其是大面积膀胱缺损修复中受到限制。为了克服这些缺点,支架材料复合种子细胞的方法被广泛采用。脂肪源干细胞（adipose derived stem cells,ASCs）来源于体内成熟的脂肪组织,因取材方便、可大量获取等特点,倍受人们关注,是一种较新颖的可用于“种子细胞”的成体干细胞。已有学者将其诱导分化为平滑肌细胞（myogenically differentiated adipose derived stem cells,MD-ASCs）,用于膀胱再生的研究,然而MD-ASCs诱导分化时间较长等劣势限制了应用价值。所以我们设想通过改良MD-ASCs诱导方案,优化种子细胞的选择。高分子聚合物合成支架材料是组织工程支架材料的重要组成部分,静电纺丝技术是组织工程构建高分子材料的方法之一。静电纺丝技术可将高分子材料在静电场中拉伸为直径为纳米级别的纤维丝,这样可大大提高材料和细胞接触面积,有利于细胞的黏附和增殖,并模拟细胞外基质环境。相对于脱细胞生物材料,静电纺丝具有如下优势:可人工控制纤维表面形状和内部结构、纤维内包裹药物或生长因子、定向排列纤维方向引导细胞生长,等等。但是高分子合成材料的生物相容性仍是需要解决的问题,现阶段研究应用较多的有:聚乳酸、聚己内酯、壳聚糖、几丁糖等,这些材料生物相容性较好,但材料的功能性较单一。有研究发现:采用组织工程支架材料进行小面积膀胱修复时,可以观察到组织学上较好的修复效果;当修复面积超过50%时,尽管尿路上皮细胞再生良好,但血管和平滑肌再生能力却欠佳,表现为膀胱替代中心区域的微血管密度低,平滑肌细胞含量少、排列紊乱、膀胱收缩功能差。透明质酸（hyaluronic acid HA）是膀胱平滑肌细胞重要的细胞外基质,HA可以促进平滑肌细胞的增殖和迁移,有研究表明:HA具有促进血管形成的作用,同时可以减少疤痕形成,促进伤口愈合。同时,HA的水溶液为粘弹性流体,填充在细胞与胶原纤维空间之中且覆盖在某些表皮组织上。在机体内其主要功能为:保护及润滑细胞,调节细胞在此粘弹性基质上的移动,稳定胶原网状结构及保护它免于受到机械性的破坏。我们设想利用静电纺丝技术构建出由透明质酸纳米纤维纺丝编织成的3D结构支架材料,模拟细胞外基质,促进细胞生长和组织修复。本次研究,我们对MD-ASCs诱导培养方案做出改进,引入17p-雌二醇（E2）,在保证成肌诱导效果的前提下,大大缩短了诱导时间,完成了种子细胞优化的诱导。同时利用同轴静电纺丝技术构造出“核-壳”结构透明质酸/聚乳酸-聚己内酯纳米支架,并选取MD-ASCs作为种子细胞验证该材料具有较好的生物相容性和物理性能。同时我们构建了大鼠膀胱缺损模型,利用穹窿状支架材料进行膀胱修补,初步探索膀胱替代修复的可行性。第一部分雌激素对大鼠脂肪干细胞增殖及成平滑肌细胞分化的影响目的:研究雌激素对大鼠ASCs体外增殖和成平滑肌的调控和影响。方法:使用胶原酶消化SD大鼠腹股沟区脂肪组织,分离培养ASCs,体外传至第3代,通过细胞的多能分化能力（成脂、成骨诱导）和干细胞表面抗原（CD45、CD73、CD90）对ASCs进行鉴定。用DMEM培养基将雌激素稀释成不同浓度（10-7、10-8、10-9 10-10、10-11）,用于ASCs体外增殖培养。利用MTS法评估不同浓度雌激素对ASCs体外增殖并选取最优化雌激素作用浓度。在成肌分化过程中,添加最适宜浓度雌激素到成平滑肌诱导培养基诱,在诱导分化2w后和4w后,采用免疫荧光、实时定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）、蛋白质免疫印迹（Western Blot）等方法检测平滑肌早期标志物（α-SMA）、中期标志物（SM22,Calponin）、晚期标志物（MHC）的表达情况。结果:MTS细胞增殖实验发现与无激素组相比,雄性大鼠来源ASCs在E2（10-7-10-10M）范围内可有效促进ASCs增殖,雌性大鼠来源ASCs在E2（10-7-10-11M）范围内可不同程度地促进脂肪干细胞增殖,两组均以10-9M E2浓度促进增殖效果最为明显。分化实验结果:诱导2w后,雌激素组细胞的平滑肌分化早期标志物（α-SMA）、分化中期标志物（SM22,Calponin）、分化晚期标志物（MHC）表达高于无激素组（p＜0.05）;诱导4w后,两组细胞的平滑肌分化早期标志物、中期标志物表达情况无差异,而晚期标志物的表达雌激素组高于无激素组（p＜0.05）。结论:1、10-9M浓度的雌激素促进ASCs的体外增殖。2、雌激素可作用于ASCs体外诱导成平滑肌分化过程,加快MD-ASCs分化成熟。第二部分聚乳酸/聚己内酯共混和透明质酸-聚乳酸/聚己内酯同轴静电纺丝纳米纤维支架生物相容性研究目的:研究透明质酸-聚乳酸/聚己内酯（HA-PLCL）同轴静电纺丝的材料结构、物理化学特性以及细胞和组织相容性,探索该支架材料修复膀胱缺损的可行性。方法:1.材料表征检测:利用同轴电纺技术制作:①PLCL单轴电纺丝②壳层是透明质酸（HA）核层是聚乳酸/聚己内酯（PLCL）的同轴电纺丝HA-PLCL③壳层是PLCL核层是HA的电纺丝PLCL-HA作为对照组对比观察。分别利用扫描电镜（SEM）和透射电镜（TEM）观察电纺丝材料的表面和内部特征;接触角测量法检测材料的亲水性;材料在PBS浸泡后固定,取其横切片观察溶胀情况;电子动静态疲劳试验机测其力学性能;PBS连续浸泡7d检测体外降解速率。2.材料的细胞相容性:利用光学显微镜、共聚焦显微镜、以及扫描电镜观察细胞的在材料上的生长形态;MTT检测细胞在材料上的增殖情况;高速离心法检测细胞在材料上的黏附情况;克隆环培养法观察细胞在材料上的迁移情况;免疫组化染色肌性标志物验证细胞在材料上肌性特征的维持。3.组织相容性及膀胱修复:将材料埋于大鼠皮下,4w后取出材料进行组织切片分析,观察炎症反应及细胞新生情况。通过切除大鼠膀胱顶部组织制作膀胱缺损模型,将支架材料缝合于缺损处,术后第4w和第8w进行膀胱容量及尿动力检测,并对修复区域组织进行组织切片观察,初步了解膀胱修复情况。结果:1.材料表征检测:扫描电镜下观察,HA-PLCL同轴电纺丝和PLCL单轴电纺丝表面平整、排列整齐、纤维粗细均匀,PLCL-HA纺丝表面粗糙、喷珠情况较严重。透射电镜观察,HA-PLCL同轴电纺丝内外层结构清晰,PLCL纺丝内部组成结构匀称单一,PLCL-HA内部结构形成类似弹丸样结构,不能均匀拉伸成丝。PLCL、HA-PLCL和 PLCL-HA 直径分别约:671±34nm、781±46nm、411±102nm。HA-PLCL 电纺丝外层单层厚度约252±56nm,内层直径约277±34nm。PLCL-HA材料的制作效率远低于其他两组。HA-PLCL和PLCL的力学性能、体外降解速率相似。HA-PLCL在PBS浸泡3d后亲水性较PLCL高,且材料内部出现溶胀、分层情况。2.材料的细胞相容性:细胞均能在两组材料上良好生长,然而在HA-PLCL材料能更早的表现出较好的细胞伸展形态,同时细胞会伸出丝状伪足;克隆环细胞实验证实,细胞在HA-PLCL上迁移较好;MTT及高速离心实验观察到细胞在HA-PLCL上增殖较PLCL快,细胞黏附也较好;α-SMA和MHC染色接种在材料上的细胞发现细胞仍可维持完整的肌性特征。3.组织相容性和膀胱修复:皮下包埋组织HE染色和CD68免疫组化证实两组材料在体内第4w时还保持比较完整系统,细胞可以在材料上或内部生长。CD68染色提示两组材料会引起轻度巨噬细胞增生,之间无明显差异;膀胱缺损动物实验结果如下:术后第4w及第8w时,膀胱修复动物存活良好,未见严重并发症。膀胱容量检测发现:随着术后恢复的时间延长从第4w到第8w,三组动物术后膀胱容量均有增加。其中HA-PLCL组平均膀胱容量最大,空白缝合组容量最小,两者之间差异明显。PLCL-HA组和空白缝合组第4w膀胱容量差别明显,但HA-PLCL和PLCL组之间没有明显差异。术后两个时间点观察到三组动物膀胱顺应性由高到低排列顺序依次为:HA-PLCL、PLCL和空白缝合组,但三组之间没有统计学差异。结论:HA可以用于制作HA-PLCL同轴电纺丝材料,HA-PLCL具有较稳定的体外降解、力学性能和体外降解速率。HA-PLCL亲水性较高,有利于MD-ASCs的黏附和生长和迁移。其组织相容性较好,用于膀胱修复可得到较满意的膀胱容量恢复。