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研究背景:糖尿病(Diabetes Mellitus,DM)是一种由遗传和环境因素共同作用而引起的以慢性高血糖为特征的代谢性疾病,其本质是胰岛素的分泌和(或)作用缺陷。当前全世界范围内糖尿病的发病率和患病率都呈明显上升趋势,而我国作为一个人口庞大的发展中国家,已成为世界第一糖尿病大国。糖尿病主要分为1型和2型,但不论是哪种类型的糖尿病,胰岛β细胞损伤和凋亡都是糖尿病发生发展的重要原因。TNF-α和IL-1β是糖尿病时存在的慢性系统性炎症的重要介导因子,可以诱导胰岛细胞凋亡,因而在糖尿病中发挥着重要作用。硫氧还蛋白相互作用蛋白(thioredoxin interacting protein,TXNIP)是目前发现的唯一内源性硫氧还蛋白(thioredoxin,TRX)结合及抑制蛋白,可以削弱TRX的抗自由基和抗凋亡功能。糖尿病时各组织TXNIP表达明显增加,研究发现高糖可以诱导INS-1细胞TXNIP m RNA和蛋白水平显著升高且伴有明显细胞凋亡。本实验室前期研究证实过表达TXNIP可通过caspase-8、9及PERK参与的内质网应激途径诱导INS-1细胞凋亡,因此,TXNIP被认为是连接糖尿病和β细胞死亡的关键环节。那么,炎性因子TNF-α和IL-1β是否可以影响INS-1细胞TXNIP的表达进而影响凋亡,若可其机制又如何?本研究的目的就在于探讨TNF-α和IL-1β诱导TXNIP变化情况及其可能机制,从而为糖尿病的预防和治疗提供新的干预靶点。目的:在正常糖脂浓度下培养INS-1细胞,外源性给予TNF-α(5ng/ml)和IL-1β(10ng/ml)刺激细胞24h,观察TNF-α和IL-1β是否引起INS-1细胞TXNIP表达变化并研究其可能机制。方法:1.实验分组:将正常糖脂浓度下培养的INS-1细胞分四组,分别为正常对照组、TNF-α组(5ng/ml,24h)、IL-1β组(10ng/ml,24h)和TNF-α+IL-1β组(5ng/ml+10ng/ml,24h)。2.外源性给予炎性因子TNF-α和IL-1β干预INS-1细胞,用CCK-8检测细胞存活率。3.流式细胞术和cleaved caspase-3两种方法检测TNF-α和IL-1β作用下INS-1细胞凋亡情况。4.Real-time PCR法检测TNF-α和IL-1β作用下INS-1细胞中TXNIP、NFκB和Ch REBP m RNA的水平。5.Western blot法检测TNF-α和IL-1β作用下INS-1细胞中TXNIP、NFκB、Ch REBP和FOXO1的蛋白表达量。6.Real-time PCR法和Western blot法检测NFκB抑制剂PDTC、p38MAPK抑制剂SB203580预处理后,INS-1细胞TXNIP、NFκB和Ch REBP m RNA和蛋白表达量。结果:1.TNF-α和IL-1β降低INS-1细胞的存活率使用不同浓度炎性因子干预INS-1细胞后,与正常对照组相比,TNF-α和IL-1β都可以浓度依赖性地诱导INS-1细胞损伤,降低细胞的存活率;且TNF-α在(5ng/ml,24h)与IL-1β在(10ng/ml,24h)时引起较明显的细胞活力下降,因此设定后期实验的TNF-α和IL-1β作用浓度分别为5ng/ml和10ng/ml,作用时间为24h。2.TNF-α和IL-1β诱导INS-1细胞凋亡Annexin-V染色流式细胞仪分析的结果显示,与对照组相比,TNF-α组、IL-1β组和TNF-α+IL-1β组细胞的凋亡率都显著升高(P<0.05),Western blot结果中代表凋亡的cleaved caspase-3表达量也升高明显,提示炎性因子TNF-α和IL-1β可以引起INS-1细胞凋亡的增加,当二者联合作用时发挥协同作用,诱导更加显著的细胞凋亡。3.TNF-α和IL-1β诱导TXNIP m RNA表达上调与对照组相比,TXNIP m RNA表达水平在5ng/ml的TNF-α和10ng/ml的IL-1β时达到高峰;而选用不同作用时间的实验也表明,此浓度下作用24h时TXNIP m RNA表达水平也显著升高。因此,后续实验分组为正常对照组、TNF-α组(5ng/ml,24h)、IL-1β组(10ng/ml,24h)和TNF-α+IL-1β组(5ng/ml+10ng/ml,24h)。Real-time PCR结果显示,各炎性因子干预组,包括TNF-α+IL-1β共同作用组,TXNIP m RNA较对照组有显著升高(P<0.05)。4.TNF-α和IL-1β诱导TXNIP蛋白表达量升高与对照组相比,TNF-α组、IL-1β组和TNF-α+IL-1β组细胞TXNIP蛋白水平升高明显(P<0.05)。5.p-NFκB、Ch REBP、FOXO1等转录因子的测定5.1炎性因子上调Ch REBP m RNA和蛋白水平与对照组相比,TNF-α、IL-1β和二者联合作用,引起细胞Ch REBP m RNA和蛋白水平都显著升高(P<0.05)。5.2炎性因子下调FOXO1蛋白表达接受TNF-α和IL-1β刺激后,各组细胞FOXO1蛋白表达量与对照组相比都显著下降(P<0.05)。5.3炎性因子上调NFκB表达与对照组相比,TNF-α和IL-1β作用下细胞NFκB的m RNA水平显著升高,同时蛋白检测显示p-NFκB水平也上升(P<0.05)。5.4 NFκB抑制剂PDTC下调炎性因子诱导的TXNIP和Ch REBP的表达应用20μM PDTC预处理INS-1细胞6h后,与炎性因子共同孵育细胞,PDTC显著抑制炎性因子TNF-α、IL-1β诱导的TXNIP、Ch REBP的m RNA和蛋白表达(P<0.05),提示炎性因子可能通过调节NFκB和Ch REBP来增加TXNIP表达,且NFκB作为上游转录因子参与调控Ch REBP。5.5 p38MAPK抑制剂SB203580减弱炎性因子诱导的p-NFκB的激活和TXNIP的表达应用20μM SB203580预处理INS-1细胞6h后,发现炎性因子作用下INS-1细胞磷酸化NFκB和TXNIP表达量都显著降低(P<0.05),提示p38MAPK作为炎症反应中的一种重要蛋白,可以通过激活核转录因子κB来诱导TXNIP改变。结论:1.炎性因子TNF-α、IL-1β可以诱导INS-1细胞凋亡。2.炎性因子TNF-α、IL-1β诱导TXNIP表达与INS-1细胞凋亡有相关性。3.炎性因子TNF-α、IL-1β可能通过p38MAPK-NFκB-Ch REBP通路上调TXNIP的表达。