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叶色突变体是一类由于叶绿素含量发生明显变化而呈现出不同叶片颜色的突变,是研究叶绿素代谢和质体发育的良好材料。叶绿素是光合作用中最主要的色素之一,对植物体非常重要,但是游离叶绿素及其前体会对植物细胞造成光氧化伤害,因此植物体进化出一系列复杂的机制来精确调控叶绿素合成过程,使其能够迅速反应于不断变化的生理生化状态以及外界环境。虽然叶绿素的生物合成过程已经研究得比较清楚,高等植物中所有的叶绿素合成关键酶也已经被鉴定了出来,但由于整个叶绿素合成调控网络的复杂性,还有很多关键的问题研究得不够深入,也无从下手。而叶色突变体中必然有叶绿素代谢过程的某一环节发生了突变,可以为我们研究叶绿素代谢调控网络提供难得的切入点。 羽衣甘蓝白鸽和乌塌菜都是十字花科芸薹属中的叶色突变体,过去对它们突变机理的研究非常稀少,是两种很有价值的研究材料。本文以羽衣甘蓝白鸽和绿鸽,小白菜和乌塌菜为研究材料,对两种叶色突变体:羽衣甘蓝白鸽和乌塌菜进行了生物化学和分子生物学分析,主要研究结果如下: (1)白鸽(Brassicaoleraceavar.acephalaf.tricolor)是羽衣甘蓝中的一种温度敏感的叶色突变体,在低温条件下其中心部分会变成纯白色。绿鸽是羽衣甘蓝中的另一个品种,在低温条件下植株仍是绿色。白鸽中的叶绿素含量在低温条件下急剧减少,而绿鸽中的叶绿素含量在相同的温度条件下只是略微减少。检测了白鸽和绿鸽中的五种叶绿素前体后发现,在低温条件下,白鸽中的叶绿素合成被抑制在Pchlide这一步,导致Mg-ProtoIX发生积累。定量PCR的结果显示低温条件下白鸽中叶绿素合成结构基因的表达从POR开始急剧降低,白鸽中的CISC和DBB1B明显受到低温的诱导而表达急剧增加。透射电子显微镜的结果显示生长在室温条件下的白鸽嫩叶中有正常的叶绿体,而生长在低温条件下的白鸽嫩叶中只有未分化的前质体。以上结果表明低温明显抑制了白鸽嫩叶中的质体发育,并通过下调下游的叶绿素合成结构基因的表达将白鸽中的叶绿素合成抑制在了Pchlide这一步,导致低温条件下白鸽嫩叶中的前质体未分化为叶绿体,白鸽嫩叶呈现为纯白色。一些与叶绿素积累相关的基因的表达也受此影响,特别是白鸽中的CISC和DBB1B,在低温条件下表达急剧增加。 (2)为了更加深入的研究羽衣甘蓝白鸽中的叶绿素合成调控机制,我们对白鸽和绿鸽花瓣、花蕾、花柄和嫩叶中的叶绿素合成情况进行了分析。结果发现这两个物种不同组织中的叶绿素含量有着完全一致的趋势,即:嫩叶中的叶绿素含量最高,花柄次之,花瓣再次,花蕾中的叶绿素含量最低。定量PCR的结果显示,绿鸽叶绿素合成结构基因基本都是在嫩叶中的表达量最高,在花柄中次之,在花瓣和花蕾中的表达量较低,与其叶绿素含量是基本对应的。白鸽上游的叶绿素合成结构基因的表达模式与绿鸽明显不同,在嫩叶中的表达量明显降低;下游的叶绿素合成结构基因的表达模式则与绿鸽非常相似,都是在嫩叶中的表达量远高于其他组织。一些与叶绿素积累相关的基因的表达情况也同时进行了分析,结果发现DBB1A、DBB1B以及GUN4在羽衣甘蓝白鸽不同组织中的的表达模式与绿鸽非常相似,而DET1和CISC在羽衣甘蓝白鸽不同组织中的表达模式却与绿鸽有较大差异。DET1和CISC均与质体发育有密切关系,很有进一步研究的价值。 (3)乌塌菜(BrassicacampestrisL.ssp.chinesis(L.)Makinovar.rosularisTsenetLee)是芸薹属中的一种高叶绿素突变体,表现为墨绿色的叶片。乌塌菜中的叶绿素含量比其同种的小白菜要高65.2％。对五种叶绿素前体进行检测后发现:小白菜和乌塌菜中的CoprogenIII含量没有明显差异,乌塌菜中的ProtoIX和Pchlide含量明显高于小白菜,而UrogenIII以及Mg-ProtoIX含量则比小白菜中略低。此外,乌塌菜中的血红素含量比小白菜中高78.13%。定量PCR的结果显示,在两个物种中HEMG2的表达没有明显差异。PPOX,ChlI,MTF,DVR,PORB和PORC在乌塌菜中的表达水平要低于小白菜中,而ChlD,ChlH,MTF,ChlP,CS和CAO则高于小白菜中。乌塌菜叶绿素合成结构基因的表达与其叶绿素及叶绿素前体含量并不是一一对应的。乌塌菜中的ChlH以及GUN4的表达水平分别是小白菜中的约1000倍和5倍。透射电子显微镜的结果显示乌塌菜叶绿体的类囊体膜系统比小白菜叶绿体发达得多,片层堆积更多,更密集。GUN4不仅是质体-细胞核信号因子,还与质体发育有关。ChlH是镁螯合酶的亚基之一,还可以作为质体-细胞核信号因子并被GUN4激活。这些结果表明乌塌菜中高表达水平的ChlH和GUN4可以一起作为质体-细胞核信号因子来调控叶绿素合成以及质体发育,可能是导致乌塌菜叶片中叶绿素含量高,类囊体膜系统高度发达的原因。 (4)根据前面实验的结果,克隆了芸薹属植物中的一些与叶绿素积累相关的基因并进行了分析: 在羽衣甘蓝白鸽、绿鸽和小白菜中分别获得了CISC的全长cDNA,都包含了2220bp的开放阅读框,并各自编码了739个氨基酸残基。蛋白质序列比对的结果显示,羽衣甘蓝白鸽BoCISCw和绿鸽BoCISCg的蛋白质序列是完全一致的,并且与小白菜BrCISCp以及拟南芥AtCISC具有很高的同源性。 在羽衣甘蓝白鸽和绿鸽中分别获得了RCA的全长cDNA,都包含了1317bp的开放阅读框,并编码了438个氨基酸残基。蛋白质序列比对的结果显示,RCA基因编码的蛋白质序列在羽衣甘蓝白鸽和绿鸽中只有两个氨基酸的差异。 在羽衣甘蓝白鸽、绿鸽、小白菜和乌塌菜中分别获得了DET1的全长cDNA,分别包含了1611bp、1611bp、1614bp和1608bp的开放阅读框,并各自编码了536、536、537和535个氨基酸残基。蛋白质序列比对的结果显示,DET1基因编码的蛋白质序列在羽衣甘蓝白鸽和绿鸽中是完全一致的,而在小白菜和乌塌菜中只有两个氨基酸的差异。 在羽衣甘蓝白鸽、绿鸽、小白菜和乌塌菜中分别获得了GUN4的全长cDNA,分别包含了771bp、771bp、771bp和783bp的开放阅读框,并各自编码了256、256、256和260个氨基酸残基。蛋白质序列比对的结果显示,GUN4基因编码的蛋白质序列在羽衣甘蓝白鸽和绿鸽中是完全一致的,并且与小白菜BrGUN4p只有一个氨基酸的差异。而乌塌菜BrGUN4w的蛋白质序列与羽衣甘蓝BoGUN4及小白菜BrGUN4p差异较大,有7个保守氨基酸发生了突变。经生物信息学分析后发现,乌塌菜BrGUN4w的等电点、疏水性等理化性质和羽衣甘蓝BoGUN4、小白菜BrGUN4p相比,都发生了改变。尤其值得注意的是,乌塌菜BrGUN4w的磷酸化位点和三维结构都发生了明显改变。羽衣甘蓝BoGUN4和小白菜BrGUN4p都只有7个Ser磷酸化位点、5个Thr磷酸化位点和1个Tyr磷酸化位点,而乌塌菜BrGUN4w有10个Ser磷酸化位点、3个Thr磷酸化位点和1个Tyr磷酸化位点。乌塌菜BrGUN4w的三维结构也比羽衣甘蓝BoGUN4和小白菜BrGUN4p少了一个β折叠结构。这些改变可能导致了乌塌菜BrGUN4w功能的改变,在调控叶绿素合成和质体发育的过程中发挥着重要的作用。