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目的应用甲基化特异性PCR(methylation specific PCR,MSP)和T-A克隆测序检测九种恶性血液病细胞系IER3基因启动子区CpG岛甲基化状态,筛选IER3基因启动子区CpG岛高甲基化的细胞株,并将其作为实验对象;探讨5-杂氮-2’-脱氧胞苷酸(5-aza-2’-deoxycytidine, 5-Aza-2’-CdR)对急性早幼粒细胞白血病NB4细胞株IER3基因启动子区CpG岛高甲基化状态及IER3基因表达的影响;探讨5-Aza-2’-CdR联合TNF-α对IER3基因表达的影响及其对NB4细胞株增值、凋亡、分化的影响。方法采用MSP检测九种恶性血液病细胞系IER3基因CpG岛甲基化状态,并用T-A克隆测序证实MSP的可靠性;MSP检测5-Aza-2’-CdR作用下IER3基因CpG岛甲基化状态的变化;qRT-PCR法检测IER3基因、DNMT1、DNMT3A、DNMT3B mRNA表达水平的变化;Western-blotting鉴定IER3基因、DNMT1、DNMT3A、DNMT3B蛋白水平的变化;采用MTT法检测5-Aza-2’-CdR及其联合TNF-α对NB4细胞系存活率的影响;Annexin V FITC/PI流式细胞仪检测细胞检测细胞凋亡率、细胞周期、细胞表面分化抗原CD11b、CD14。结果⑴经过MSP的检测,IER3基因启动子区CpG岛异常甲基化在九种恶性血液病细胞系中广泛存在,并通过T-A克隆测量来证实了MSP的可靠性。⑵5-Aza-2’-CdR作用48h后MSP检测IER3基因甲基化程度有所降低,但降低不是很明显。⑶qRT-PCR检测结果显示5-Aza-2’CdR作用48h后能在mRNA水平下调DNMT1、DNMT3A、DNMT3B的表达,尤其以DNMT1下调最为显著,且呈药物浓度依赖性;单独应用5-Aza-2’CdR和TNF-α都可以上调IER3基因的mRNA表达水平,但二者联合应用明显上调IER3的mRNA表达水平,且对5-Aza-2’CdR呈浓度依赖性。⑷Western-blotting结果显示:5-Aza-2’-CdR可以在蛋白水平抑制DNMTs的表达,其中对DNMT1的抑制作用最为明显;单独应用5-Aza-2’-CdR和TNF-α都可以促进IER3的蛋白水平的表达,且对5-Aza-2’-CdR呈浓度依赖性;联合应用药物对IER3蛋白水平的上调作用较单独用药更为明显。⑸MTT法检测药物作用NB4细胞48h、72h结果显示:单独应用5-Aza-2’-CdR或TNF-α对NB4细胞生长都具有抑制作用,且随着5-Aza-2’-CdR浓度的增加,抑制作用呈上升趋势,二者联合应用48h后与单独应用5-Aza-2’-CdR抑制作用没有明显差异,但二者联合应用72h后对NB4的抑制作用明显强于单独应用5-Aza-2’-CdR。药物作用48h后加药组与未处理组比较差异均有统计学意义,但2与5、3与6相比较差异没有统计学意义,即P>0.05;72h后加药组与未处理组比较差异均有统计学意义,且2与5、3与6相比较差异也具有统计学意义,即P<0.05。⑹Annexin V FITC/PI流式细胞仪检测药物作用48h后的NB4细胞显示:联合应用5-Aza-2’-CdR和TNF-α较单独应用药物促细胞凋亡作用更明显,且以晚期凋亡为主;联合用药较单独用药对细胞S期的抑制作用更明显;联合应用5-Aza-2’-CdR和TNF-α较单独用药更能促进细胞表面抗原CD11b、CD14的表达。均对5-Aza-2’-CdR呈药物浓度依赖性;各个加药组与未处理组比较差异均有统计学意义,且2与5、3与6相比较差异也具有统计学意义(P<0.05)。结论⑴在恶性血液病细胞系中IER3基因启动子区CpG岛异常甲基化广泛存在。⑵在NB4细胞系中5-Aza-2’-CdR能够通过抑制甲基化转移酶上调IER3的表达,其中主要是抑制DNMT1,且对5-Aza-2’-CdR呈浓度依赖性。⑶5-Aza-2’-CdR联合TNF-α较二者单独用药更能上调IER3的表达。⑷5-Aza-2’- CdR联合TNF-α较二者单独用药明显抑制NB4细胞的增值,明显缩短细胞S期,更能促进NB4细胞的凋亡、分化。