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桃[Prunus persica(L.)Batsch]属于蔷薇科(Rosaceae),李属(Prunus L.),我国是桃起源中心,具有4000多年的栽培历史,主要分布于北纬23°～45°的范围内,种植面积和产量均居世界第一。自然变异和人工选育积累了丰富的品种或品系.根据果实形态特征可将桃分为6大品种群即硬肉品种群、蜜桃品种群、蟠桃品种群、油桃品种群、黄桃品种群和水蜜桃品种群。水蜜桃品种群属于主要的鲜食品种类型,几乎在桃的各生产区均有栽培。桃品种繁多,来源复杂,很多品种来源于芽变或实生选育,在形态上表现很相似,因此不可避免存在同物异名和同名异物现象。鉴别品种构建指纹图谱,可为保护果树育种者和栽培者权益提供可靠依据。
果实硬度是果实品质的一个重要指标,不同水蜜桃品种果实硬度的遗传基础目前仍然不清楚,蕴藏着较大的选择潜力,选出硬度较大可鲜食的水蜜桃品种,可延长货架期,提高社会经济效益。
本研究旨在从分子水平上探讨我国水蜜桃种质资源的遗传多样性和亲缘关系,指纹图谱的构建,以及果实硬度变化的遗传基础为有效保存和利用水蜜桃的核心资源以及遗传育种提供理论依据,主要结果如下:
1.基于SSR标记技术的水蜜桃遗传多样性分析
从均匀分布于桃T×E遗传连锁图谱8条连锁群上的56对SSR引物中,筛选出34对条带清晰、具有多态性的SSR引物对浙江奉化收集保存的94份水蜜桃样品进行了遗传多样性分析.共扩增出97个等位基因,其中93个等位基因表现出多态性,占95.9％.每个SSR位点产生2.5个等位基因,平均2.85个。观察杂合度Ho在0.05至0.84之间,平均值为0.48。有效等位基因数Ne和多态信息含量PIC的变化范围分别在1.05到3.66,0.05到0.68,平均值各为2.04和0.4,揭示了水蜜桃遗传基础较狭窄。在扩增产生的97个等位基因中,分别出现了6个特异等位基因和7个稀有等位基因。来自浙江奉化地方品种或品系的48份水蜜桃样品的遗传多样性比其它46份引进品种低。根据SSR扩增结果采用UPGMA法将94份样品聚类成两大类群,第1类群从白凤1到砂子早生包括34个引进品种和2个奉化地方样品组成；第2类群(浅间白桃至早上海水蜜)由58份样品组成,其中48个为奉化地方品种或品系,10个为引进品种,基本与样品材料的地理起源一致。该结果表明奉化长期以来很少与外界进行桃种质资源交流,几乎都是从地方奠基品种繁殖而来。在94个样品中只有5个品种即金君、建方、林家、上山大玉露和西圃1号未能鉴别区分,这5个品种可能是同物异名,或许发生的遗传变异未在本实验检测的34个SSR位点上。
2.水蜜桃和杨梅品种指纹图谱的构建
从34个SSR位点中筛选出12个(采用多重标识引物PCR)用于水蜜桃品种鉴定、谱系分析。12对桃荧光SSR引物,在44份水蜜桃样品中共得到39个等位基因,每个位点产生2-6个,平均为3.25。在杨梅中,10对SSR引物在52份材料中分别产生4-12个等位基因,共产生84个,平均为8.4。在建立水蜜桃指纹图谱中,发现应用荧光SSR标记较普通SSR标记能获取更为准确而丰富的等位基因,如位点PTS1,在PAGE胶中只出现3个等位基因,而用荧光标识该标记则获得了6个等位基因,类似位点还有CPPCT040、CPPCT022、BPPCT007、PBBCT020、EPPCU1090。另外,相同引物在不同的仪器中会导致指纹片段发生一定改变,需2-3个品种作为固定参照进行矫正.采用类似方法建立了基于10个SSR标记的杨梅品种指纹图谱,可应用于品种鉴定、谱系分析以及连锁图谱构建。
3.endo-PG基因单核苷酸多态性(sNPs)与桃软化性状的关系
endo-PG基因由4个外显子(444 bp、290 bp、231 bp和217 bp)和3个内含子(256 bp249 bp和573 bp)组成,共编码393个氨基酸。以cDNA为模板,新获得6个品种的endo-PG的ORFs序列,与报道的3个参考品种比较,共发现14个单核苷酸碱基变异,其中2个SNPs(146 bp和806 bp)为非同义变异。溶质和非溶质之间在146 bp和576 bp分别出现特异单核苷酸变异(C／T、T／G),但这些变异位点也存在于溶质桃endo-PG基因DNA编码区相应位置上。溶质桃之间存在12个SNPs,其中肥城桃在93 bp和348 bp分别具有特异的单核苷酸变异。14个SNPs共形成4种单倍型,其中HAP1和HAP2较普遍。在这14个SNPs中,未发现与溶质桃硬度以及桃溶质与非溶质性状相关的单核苷酸变异,而HAP1和HAP3在硬溶质水蜜桃中出现的频率较高。在水蜜桃果实软化过程中,endo-PG基因的表达逐渐升高至最大值,然后迅速降低,表明endo-PG基因可能参与了水蜜桃果实软化过程,但不直接相关。其表达强度和模式在水蜜桃品种间存在较大差异。乙烯可能是引起水蜜桃果实软化的关键物质,为endo-PG基因表达的诱导因子之一。从山桃、甘肃桃、光核桃和15个桃品种中得到了25条endo-PG基因DNA序列用于单核苷酸多态性分析,共发现85个SNPs(其中包括8个InDel,将InDel作为SNPs处理),占全基因长度的3.77％即大约26.6 bp就产生1个突变碱基.在4个外显子中共发现15个SNPs,其突变率为1.27％,12个SNPs为同义突变,剩余3个SNPs为非同义突变,除了在1306 bp和1311 bp的SNPs外,其余SNPs与上述cDNA变异位点相对应,15个SNPs共形成13个单倍型。在3个内含子中共有70个SNPs,其突变率为6.50％,明显高于外显子的突变率,表明内含子的保守性显著低于外显子.endo-PG基因存在丰富的单核苷酸多态性,其θw=0.0087；n=0.01322.内含子的θw与π值明显都高于外显子,表明内含子的单核苷变异较外显子高.另外,比值dN／dS=0.31,远低于1,表明了endo-PG基因在演化过程中受到了较强的反向选择。