吐鲁番黑羊精子发生的抗热应激机制的研究

• 作 者: 宋玉坤
• 机 构: 新疆农业大学
• 出 处: 新疆农业大学
• 发表日期: 2022年01期
• 关键词: 热应激 精子发生 减数分裂 RNA-Seq 吐鲁番黑羊
• 基金项目: 国家自然科学基金项目“黑萨福克与多浪羊杂交改良与快速繁育技术研究与应用”的部分研究成果（项目编号:2016E02037）课题主持人:阿布力孜·吾斯曼教授（新疆农业大学）

随着养殖业集约化和规模化的发展以及全球性气温的普遍升高,动物热应激也越来越严重。热应激会直接或间接影响动物生理、生产和健康等,给养殖业带来一定的经济损失。目前动物热应激的研究对象主要为奶牛、鸡和猪,而有关绵羊热应激的研究报道甚少。因此,开展绵羊热应激的研究就显得更为迫切。绵羊处于高温高湿的环境中,究竟是哪些基因和代谢通路在发挥调控作用?鉴于此,寻找与绵羊热应激相关的基因及调控通路。主要研究结果如下:1.首先我们统计了从无热应激到强热应激时间段的绵羊体温,发现开始热应激时两组绵羊的不同部位的温度开始升高,之后一直维持在高热水平,尤其体现在萨福克绵羊。我们也采集了热应激期间的血清,通过放射免疫的方法检测生殖激素和氧化应激指标的变化,结果表明在热应激处理过程中两组绵羊检测指标都发生了波动,吐鲁番黑羊相对平稳,而萨福克绵羊出现了显著的波动。2.通过对精子活力、密度和运动性能检测后发现,随着热应激强度的增加,萨福克绵羊各项指标出现极显著的降低（P＜0.01）,而吐鲁番黑羊虽然出现下降趋势,但是并没有达到显著水平。接着本研究在顶体染色和DNA碎片化的检测中发现,热应激后吐鲁番黑羊与热应激前没有显著差异,而热应激处理后的萨福克绵羊出现大量的精子顶体不完整和DNA碎片化比例高的现象（P＜0.05）。3.对采集到的睾丸组织进行切片H＆E染色。形态学结果显示,切片组织形态完整,所有类型的生殖细胞包括精原细胞、精母细胞、圆形精子和长形精子均已出现在每个实验动物睾丸组织中,无明显差异。借助免疫荧光技术对睾丸曲细精管内支持细胞、精原细胞和精母细胞进行定量分析。结果发现,热应激前后的吐鲁番黑羊和萨福克绵羊曲细精管内精原细胞和支持细胞的数量没有减少,而热应激后萨福克绵羊的精母细胞出现了明显的减少。随后我们利用减数分裂展片对整个减数分裂I期进行分析,其中两种绵羊热应激处理后都包含了全部时期的细胞,说明两组绵羊均可以完成减数第一次分裂。但是通过对比每个时期的细胞占比,发现萨福克绵羊减偶线期的细胞比例显著高于吐鲁番黑羊。因此我们推测萨福克绵羊在热应激环境下并非所有细胞都可以完成减数分裂,大量的细胞粗线期发生阻滞,随后发生凋亡。4.通过RNA-Seq数据分析,对两种绵羊热应激前后的数据进行差异表达基因、GO富集和KEGG通路分析,结果显示:热应激前后吐鲁番黑羊GO富集有细胞对刺激的反应、细胞发育过程、细胞周期过程、减数分裂细胞周期过程和双链断裂修复等生物学过程,KEGG通路有Rap1、Ras、细胞周期、胞减数分裂、Fox O、m TOR信号通路、Notch信号通路等;热应激前后萨福克绵羊GO富集有凋亡过程、发育过程的负调控、程序性细胞死亡、稳态过程的调节等,KEGG通路有血小板活化、癌症中的胆碱代谢、AMPK等;共有差异基因GO富集有线粒体呼吸链复合体I、组蛋白乙酰转移酶活性、ATP酶活性、转录共激活因子活性等,KEGG通路有氧化磷酸化、癌症中的蛋白聚糖、PI3K-Akt信号通路等。通过对比差异基因的GO富集和KEGG通路发现,组间的通路主要分为3类:1.在吐鲁番黑羊中为调控精子发生和减数分裂相关;2.在萨福克绵羊中为细胞凋亡及炎症反应、适应性有关;3.共有差异基因中是氧化应激适应能力相关。同时,我们挑选出标志性基因后也发现均发生了上调,如:减数分裂相关基因SYCP2、BRCA1、TEX15、SMC4、SMC3、SETX、RAD54L、MEIOC、MCM8、MCM6、CENPF、TEX11、SMC5、RPA1等,细胞凋亡相关基因CASP8、TBK1、CFLAR、FOXO1、ADORA1、CASP8、MAP3K1等,氧化应激相关基因NDUFB3、NDUFA8、NDUFA6、NDUFB7、HLTF、MYO9B、TFAP2A、MED13、MYSM1、STAT3等。本研究结果揭示了吐鲁番黑羊在热应激中激素调节变化以及精原细胞转变、减数分裂细胞和单倍体生殖细胞发育受到大量基因变化的调控。转录组分析为精母细胞以及精子发生所提供的候选基因在热应激中发挥重要作用。参与精子发生相关基因上调,保护了热应激处理的吐鲁番黑羊精子的正常生成,从而达到在生殖功能正常,进一步证明吐鲁番黑羊在长期的热应激环境中进化了一种抗热应激的能力。