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脂肪酶在食品、化工及医药等行业具有广泛需求，其中米黑根毛霉脂肪酶是一种应用于手性拆分及定向催化领域的重要生物催化剂。异源表达及分子改造是一种提高脂肪酶表达量及热稳定性的有效手段，但应用于米黑根毛霉脂肪酶的效果仍相对较差，即现有单一启动子工程菌表达水平低下，热稳定性改造方面仍无统一的规律可循。 本文首先通过密码子优化，构建pPIC9K-rml表达载体，成功在毕赤酵母中表达米黑根毛霉脂肪酶RML。经过三丁酸甘油酯及罗丹明平板筛选，获得表达量与已报道的最高表达量相似的RML毕赤酵母表达菌株A7。结合平板筛选及膜印迹的方法，建立了一种可对分泌性脂肪酶进行高通量筛选的膜印迹方法。通过结合易错PCR的方法及膜印迹高通量筛选方法，经第一轮定向进化得到一个耐热性相对野生型提高的RML突变子G10(突变位点E47K)。以G10为亲本一方面进行第二轮进化得到耐热性与耐甲醇性能都有所提高的突变子G10-11与G10-20。野生型RML的T5060值为58℃，而G10-11与G10-20的T5060值分别为70℃与64.5℃，相比野生型分别提高了12℃与6.5℃;另一方面引入5个新的盐桥并对其热稳定性进行筛选，最终获得2个能够有效提高RML热稳定性的盐桥T31R与T231K，其Tm值分别提高了5.2℃、3.2℃;对三个能够提高RML热稳定性的盐桥进行随机组合，双盐桥组合突变子T31R/E47K、T31R/T231K、E47K/T231K的Tm值分别提高了7.4℃、6.9℃、6.2℃，而三个盐桥组合突变子T31R/E47K/T231K的Tm值提高了8.3℃。R31-D39、K47-D44及K231-D226的盐桥翻转突变子R31 D/D39R、K47D/D44K、K231D/D226K的Tm值分别为56.7℃、56.8℃、57.9℃，其△Tm分别为4.7℃、4.8℃、5.9℃。盐桥K47-D44翻转后热稳定性有所减低，盐桥R31-D39，K231-D226翻转后其热稳定性则有所提高，尤其是K231-D226翻转变为K231D/D226K后其△Tm值由3.2℃变为5.9℃。通过盐桥的翻转，获得了热稳定性提高的突变子，也再次证明了盐桥对热稳定性的作用。 利用分子动力学模拟对南极假丝酵母脂肪酶(Candida Antarctica lipase)结构进行分析，结果表明:在303K～453K温度范围内，CALA的RMSD与RMSF变化较小，说明蛋白的整体刚柔性变化不大;在二级结构作用力方面，随着温度升高， CALA的氢键数目减少，亲水性增加，两个二硫键的距离基本不变，盐桥总数减少。CALA抵抗高温带来的压力的结构作用力被分为三个层次:第一层作用力主要为大部分氢键与位于蛋白表面的差异盐桥，这个层次的作用力相对较弱但数量较多;第二层次作用力为疏水作用力及大部分盐桥，这一层次作用力的消失将会使蛋白结构越来越不稳定;第三个层次是二硫键及共价键，这是维持蛋白结构稳定保持催化活性的最关键作用力。 利用分子动力学模拟对G10-11与G10-20进行分析，结果表明:与野生型RML相比，G10-11与G10-20具有更低的RMSD与RMSF值，说明它们的结构变得具有更大的刚性。进一步对G10-11与G10-20二级结构作用力进行分析表明:G10-11与G10-20热稳定性与耐甲醇性能的增加的原因可能是一是由于突变后盖子结构区域的疏水性增加，而表面区域亲水性增加;二是由于突变增加了新的盐桥从而使盐桥网络发生变化。利用分子动力学模拟对三个盐桥组合突变酶T31R/E47K/T231R进行分析，结果表明:与野生型RML相比，三个盐桥组合突变酶T31R/E47K/T231R具有更大的结构刚性，氢键数目稍微增加，新形成的三个盐桥R31-D39、D39-K47、D226-K231十分稳定且对蛋白稳定起到重要作用。 利用联合AOX1与GAP双启动子在毕赤酵母中共表达RML:成功构建AOX1与GAP双启动子表达RML毕赤酵母工程菌株，经筛选得到3株表达量提高的突变株3-17、4-16、z-24，其表达量分别提高到140 U/mL、105 U/mL、125 U/mL。通过响应面优化，确定了双启动子表达RML的最优条件。在此条件下将RML的表达量提高到175 U/mL，是野生菌株的5.8倍。用实时定量PCR测定突变株中的AOX1与GAP双启动子各自的拷贝数，分析得到双启动子提高表达量的原因一方面是基因总拷贝数的增多，另一面是双启动子的协同作用，这种协同作用来源于一个启动子的引入在一定程度上缓解了拷贝数极限对另一启动子的抑制。