【摘 要】
：
目的：分别构建载有蓝氏贾第鞭毛虫(Giardia lamblia，简称贾第虫)PPDK和PK特异性锤头状核酶的贾第虫病毒重组载体。检测二者在贾第虫细胞外和细胞内切割各自靶mRNA的能力，为进一
论文部分内容阅读
目的：分别构建载有蓝氏贾第鞭毛虫(Giardia lamblia，简称贾第虫)PPDK和PK特异性锤头状核酶的贾第虫病毒重组载体。检测二者在贾第虫细胞外和细胞内切割各自靶mRNA的能力，为进一步探讨PPDK和PK在贾第虫能量代谢中的功能提供实验依据。
材料与方法：复苏液氮保存的贾第虫C2株滋养体，用改良TYI-S-33培养基进行纯培养并传代。收获处于对数生长期的虫体，提取基因组DNA。依据登录于GenBank的贾第虫丙酮酸磷酸双激酶(PPDK)和丙酮酸激酶(PK)的基因序列(序列号分别为U43531和XM764552)，采用RNA draw软件对其二级结构分别进行模拟分析，按照G：C比例及锤头状核酶设计原则，选取各自合适的酶切位点，设计特异性锤头状核酶序列。参照文献设计合成特异性引物，通过PCR扩增得到构建载体所需的目的片段及两种核酶片段。经酶切连接将核酶片段载入犬贾第虫病毒(GCV)载体，获得重组质粒。测序后选择正向插入且序列正确的阳性质粒。将阳性重组质粒线性化并进行体外转录，体外转录产物进行细胞外切割反应并经电击转染对数生长期的贾第虫滋养体。细胞外切割反应中设置H5和H3两实验组和一个阴性对照组，用荧光实时定量PCR(RealTime-PCR)检测每一核酶对其靶mRNA的切割效率。根据实验目的设置A(GFP转染组)、B(pGCV634/H5/2174转染组)、C(pGCV634/H3/2174转染组)和D(电击对照组)4个组进行电击转染。转染后24 h，分别提取各组虫体总RNA，用RealTime-PCR检测两种核酶对其靶mRNA的切割效率。
结果：成功设计了蓝氏贾第鞭毛虫PPDK和PK特异性锤头状核酶序列，并经PCR扩增获得了两种核酶片段(H5和H3)及构建载体所需要的GCV5端的634和3端的2174片段。双酶切鉴定和测序结果表明，重组质粒pGCV634/H5/2174和pGCV634/H3/2174构建正确。细胞外实验RNA分析结果表明，H5组中PPDKmRNA水平下降了57.1％，H3组中PKmRNA水平下降了58.5％。转染后24h细胞内实验RNA分析结果表明，pGCV634/H5/2174转染组中PPDK mRNA表达量降低至正常组的30.85％，但PKmRNA水平与正常组无统计学差异；pGCV634/H3/2174转染组中PK mRNA表达量降低至正常组的33.14％，但PPDKmRNA水平与正常组无统计学差异。
结论：成功构建了分别载有蓝氏贾第鞭毛虫PPDK和PK特异性锤头状核酶的GCV重组载体，pGCV634/H5/2174和pGCV634/H3/2174；细胞外切割实验和电击转染后RNA分析结果表明，构建的两种核酶重组载体均能在贾第虫细胞外有效切割各自的靶序列；两种体外转录产物经电击转染贾第虫滋养体后，均对各自靶序列进行了特异性切割。本结果为PPDK和PK在贾第虫能量代谢中催化功能的进一步研究提供了有价值的实验资料。
其他文献
摘要：结合近年来的高考，从高考理科综合卷分析报告看，考生普遍存在的问题主要是：（1）基本概念不清；（2）设计实验能力不强；（3）试题阅读理解能力弱；（4）文字表达能力差；（5）专业术语应用不熟悉。或称为六个“不够”：审题不够仔细，书写不够规范，基础不够扎实，思维不够灵活，表达不够清楚，实验不够重视。事实上这几个方面通过复习策略的调整，是会得到很大程度改进的。下文结合考纲，浅谈高中生物学科的全面复习
进入初三最后一个月，大部分学校都已经完成了第一第二轮的复习。而数学这一科，作为中考的得分大户，在中考前的最后一个月，应该怎样合理的制定复习计划，让最后一个月的复习更有效率和有针对性呢？本文针对最后一个月的中考数学复习，提出有效的备考策略和复习建议。 一、知己知彼，百战不殆 如果把中考当着一场战役的话，数学考试就是其中的一场战争，那么，在打仗之前，我們要做的第一件事情是什么呢？所谓知己知彼，百战
“九五”国家科技攻关“96－002－02－15”甘蔗育种材料与方法研究专题合同于1996年9月在北京草签之后，该专题的8个承担、参加（协作）单位的第一主持人于同年11月11－14日在福建农业大学
摘要：进入高中后，学生将会见识更为丰富多彩的物理现象，学到更为深刻的物理知识，进一步领悟科学研究的方法，增进对科学精神的陶冶。我在教学实践中发现，刚步人中学的高一学生，他们的思维方式很大程度还存在初中阶段已形成的习惯，主要表现为重识记而轻分析综合。显然，培养思维能力，特别是抽象逻辑思维能力是开发智力的关键。在高中物理教学中以提高学生抽象逻辑思维能力，特别是理论型逻辑思维能力，是需要也是可能的。
摘要：创设有助于学生自主学习的学习情境，引导学生通过实践思考，探索交流，获得知识，形成技能，发展思维，学会学习，促使学生在教师指导下生动活泼地、主动地、富有个性地学习。创设适当的问题情境可以激发学生的学习兴趣和学习动力，使学生产生“疑而未解，又欲解之”的强烈欲望，进而转化为一种对知识的渴求．从而调动学生的学习积极性和主动性，达到提高课堂教学效果的目的。 关键词：初中数学 创设 教学情境
摘要：在冰心翻译的纪伯伦的《论孩子》中有这样的话：“你可以给他们爱，却不可以给他们思想，因为他们有自己的思想。”笔者认为，教育的本质是爱，教学的根本任务不是训练学生不假思索地全盘接受教师的观点，做一个合格的模仿者，而应逐步引导学生自主思考问题，得出结论。所以，有效的高中政治课堂应当是师生双方“心动大于行动”，思维的火花在师生的互动中不断地闪烁，应当有碰撞、有异见、有争论、有质疑。 关键词：高中政
摘要：进行创造性教学，培养创新人才是时代的需要。小学数学教学应以学生的自主活动为主旋律，让学生做学习的主人，主动积极地学习，勇敢进行探索，在自主探索中获得新知识，解决新问题，提高学生的创新能力。 关键词：小学数学 自主探究 一、营造氛围，萌发自主探索学习意识 要营造宽松、和谐的氛围，教师首先要充尊重学生，把学生视为有人格的、平等的、自主的人，这样他们才能因亲其师而信其道；其次，在教学中教师要
摘要：写作能力是语文素养的综合体现，是语文教学的重要内容之一，也是语文教学的难点。提到写作，小学生就感到无从下手。他们怕作文，不爱写作文。本文如何提高小学生的写作能力略抒己见，意在抛砖引玉。 关键词：小学语文 写作能力 策略 写作是运用语言文字进行表达和交流的重要方式，是认识世界、认识自我、进行创造性表述的过程。在实际教学中，面对作文，学生怕写、不会写，没啥可写的现象时有发生。那么，怎样改
摘要：实施素质教育已成为中小学教学改革的主旋律。中专语文教学中，教师应和转变教学理念和教学模式，积极实施素质教育。 关键词：语文教学 综合 素质 想象思考 一、激活文字，创设形象 语文教材出现在学生眼前的仅仅是一行行文字。如果不展开想像,不懂得进行再创造,那么出现在头脑中的可能只是词语所代表的抽象概念,而无表象组成的生动画面。这样,就不可能进入作者所创设的意境之中,不仅无欣赏乐趣
摘要：兴趣可以激发情感，培养意志，可以唤起某种动机，改变态度。在小学数学教学中，有目的、有计划、有步骤地培养学生的兴趣，有助于学生发现事物的新要素,并进行探索创造。本文就在小学数学教学中如何培养学生的学习兴趣，谈了几点体会。 关键词：小学数学 兴趣培养 兴趣是一种带有情感色彩的认识倾向。它以认识和探索某种事物的需要为基础，是推动人去认识事物，探求真理的一种重要动机，是学生学习中最活跃的因素