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精子发生是一个复杂的生理过程,对温度具有高度的敏感性。睾丸是雄性精子发生的场所,一般情况下处在阴囊内,悬垂于体外,其温度比体温低2～4℃。但近年来由环境、病理等多种原因诱发的睾丸热应激成为雄性生殖疾病和不育的一个重要因素。据统计,睾丸温度每升高1℃,精子发生效率降低约14%。热应激的累积,还可导致睾丸萎缩、精子发生受阻、精子密度下降甚至不育等严重后果。睾丸单次热应激或隐睾会引起生精上皮的损伤和生殖细胞的消亡,但其具体的损伤过程及机制尚不完全清楚,不利于生产中应对热应激诱发的雄性生殖细胞损伤的预防和治疗。本研究以小鼠39/42℃水浴20 min睾丸单次热应激为模型,探究热应激引起的生精上皮损伤的病理学进程,进一步研究热应激后生殖细胞损伤的机制,同时评估褪黑素对热应激诱发的生殖细胞损伤的预防和治疗效果。并以手术型隐睾模型为基础,利用组织形态学鉴定、免疫组化及单细胞转录组测序和生物信息学分析等方法,探究隐睾症抑制精原细胞分化,导致精子发生阻滞的分子机制。本研究的主要研究结果如下:1.单次39℃热应激虽未引起睾丸内的明显损伤,但亚细胞结构和分子生物学检测发现该处理可以诱发生殖细胞内的自噬;而当热应激温度升高至42℃后,引起睾丸内明显的病理性损伤,持续强烈地氧化应激反应和生精上皮的空泡化。在损伤过程中,以精母细胞的凋亡为主;圆形精细胞则以多核聚细胞的形式脱离生精上皮;支持细胞间的紧密连接被破坏。2.不同温度单次热应激后,睾丸组织内的分子变化具有显著的差异。在39℃热应激后,睾丸内JNK MAPK通路表现为短暂激活,诱发自噬,热休克蛋白HSPA2在精母细胞的胞质内表达升高;而42℃热应激后,睾丸组织内JNK MAPK和P38 MAPK信号通路均被持续强烈性激活,诱发精母细胞凋亡,同时,发生凋亡的精母细胞呈现HSPA2蛋白表达缺失或由细胞质向细胞核的异常移位。3.褪黑素在热应激前的预处理,使生精上皮损伤的曲细精管比例由94.22±3.76%降低至32.1±2.88%,损伤小管内凋亡细胞数量由64.89±5.13减少至17.34±3.87,并可降低睾丸组织内的氧化应激反应。Western Blot检测显示,在褪黑素预处理组,热应激睾丸组织内JNK和P38活化减弱,凋亡反应下降。褪黑素预处理对热应激诱发的生精上皮损伤起到了良好的预防作用。4.在热应激后及时施加褪黑素,可以有效地抑制曲细精管内圆形精细胞的多核聚细胞现象。同时,连续施加褪黑素,加速了睾丸内精子发生的恢复。褪黑素的治疗可以保护支持细胞间紧密连接蛋白的正常表达和定位,维持血睾屏障的完整性,加速损伤后生精上皮的恢复,对热应激诱发的生精上皮损伤有良好治疗作用。5.小鼠手术型隐睾模型显示,隐睾会导致睾丸内精子发生停止,生精细胞阻滞在精原细胞阶段。单细胞转录组测序分析显示,睾丸内管周肌样细胞和内皮细胞占全睾丸细胞的比例升高至正常睾丸的330倍,这两类细胞分泌的胶质细胞源性神经营养因子(GNDF)对精原干细胞具有促增殖抑分化作用,推测可能导致了隐睾小鼠精原干细胞的分化抑制;同时,隐睾使分化的精原细胞无法正常表达后续精子发生所需的m RNA,且癌症相关基因表达量升高,导致精原细胞进入减数分裂受阻。综上所述,本研究系统地探讨了睾丸热应激后自噬、凋亡和氧化应激反应的发生,并评估了褪黑素对热应激型睾丸组织损伤的预防和治疗效果。单细胞转录组测序分析结果显示,隐睾可引发精原细胞转录水平的改变,抑制精原干细胞的分化,导致精子发生在精原细胞阶段阻滞和雄性不育。由于睾丸热应激干扰精子发生,导致精子减少和精液品质下降,本研究进一步了解睾丸热应激反应及其分子机制,有助于开发针对热诱导雄性生殖疾病的治疗方法。此外,本研究发现褪黑素可以保护睾丸组织免受热应激损伤,有可能成为治疗由热应激因素引起的雄性疾病的药物。