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生物柴油是新兴的“绿色能源”，大力发展生物柴油对经济可持续发展、推进能源替代、减轻环境压力、控制城市大气污染具有重要的战略意义。脂肪酶能够催化油类和醇通过酯交换反应生成生物柴油，不但反应条件温和，且反应副产物少、产物易于分离，然而由于酶的活力低、易受甲醇抑制等问题使得生物柴油转化率较低，难以形成大规模生产。本实验意在通过对微生物脂肪酶基因的异源表达和定向进化获得酶活力和甲醇耐受性适于催化生物柴油的菌株，使其能更有效地催化生成生物柴油，并且是国内首次对酿酒酵母脂肪酶基因的克隆、重组表达及酶学性质进行研究。
克隆了酿酒酵母脂肪酶基因TGL3，构建了表达载体pSE380-TGL3、pET-22b-TGL3和口pPIC9K-TGL3。将pSE380-TGL3和IpET-22b-TGL3分别转化到大肠杆菌JM109(DE3)、BL21(DE3)和Rosetta细胞中，诱导表达没有检测到酶活，SDS-PAGE分析也没检测到目的表达条带，基因TGL3在大肠杆菌中表达失败。将pPIC9K-TGL3转化到毕赤酵母GSll5中，用甲醇诱导表达，发酵120h时发酵液粗酶活力达到最大为60U/mL，是野生酶的10倍。SDS-PAGE分析，表达蛋白大小约为70kD。酶学性质分析得知该酶的最适作用温度为40℃，最适pH为8.5，Tm为45。C，在pH8-9之间较稳定，Km值约为3.3mg/mL，大多数金属离子对该酶没有影响。
分别采用易错PCR和反向PCR技术对粘质沙雷氏菌脂肪酶基因LIPA进行了随机突变和定点突变，最终获得四个有酶活力的突变体：epl、ep2、E122F和D388I。分别对野生型和突变型脂肪酶进行了镍柱亲和层析纯化和纯化酶酶学性质分析，纯化后只有大小为64kD的单一蛋白条带，酶学性质分析表明：突变体epl的比活力比野生型提高了425U/mg;epl和D388I的Tm分别比野生型提高了3℃和2℃；ep2、E122F和D388I的最适反应温度分别由野生型的40℃降低为25℃、30℃和25℃；除E122F外其余三个突变体的Km值都比野生型明显减小。