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肝纤维化（hepatic fibrosis，HF）是由各种致病因子如病毒、酒精、化学药物等引起慢性肝细胞损伤，导致细胞外基质(extracellular matrix，ECM)过度沉积，纤维结缔组织异常增生的一个病理过程。肝纤维化是肝炎发展为肝硬化、肝癌的必经阶段，因此预防、治疗甚至逆转肝纤维化成为慢性肝病研究的重点。 肝星状细胞(hepatic stellate cells，HSCs)与肝纤维化的形成密切相关，当肝脏受到损伤刺激时，静止状态的HSCs转化为激活状态的肌成纤维细胞样细胞（myofibroblast cells，MFCs），引起ECM合成及降解异常，导致肝脏结构和功能的改变。ECM的主要成份是胶原，在肝纤维化中主要以Ⅰ、Ⅲ型胶原明显增加为主。胶原代谢受到基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinases，MMPs)及基质金属蛋白酶抑制剂(tissue inhibitor ofmetalloproteinases，TIMPs)的调节。因此HSCs的活化是肝纤维化形成的中心环节。 肝纤维化的形成伴随着Raf-1/MEK/ERK1，2信号通路的激活，该通路的激活可以促进HSCs的增殖、分化和迁移。Raf激酶抑制蛋白(raf kinaseinhibitor protein，RKIP)是磷脂酰乙醇胺结合蛋白家族(phosphatid-ylethanolalmine binding proteins，PEBPs)中的成员，从植物到哺乳动物都有发现，可以调节多种信号通路的转导。RKIP与Raf-1激酶域相互作用，抑制Raf-1/MEK/ERK1，2信号通路的转导。而RKIP的过表达可以促进HSCs的迁移。Locostatin是一种无抗菌活性的黄恶唑酮衍生物，是RKIP特异性抑制剂。本论文应用四氯化碳(carbon tetrachloride，CCl4)诱导小鼠肝纤维化形成，并通过腹腔注射Locostatin进行干预，旨在研究Locostatin对小鼠肝纤维化的影响及其作用机制。 目的: CCl4诱导小鼠肝脏纤维化过程中，腹腔注射RKIP特异性抑制剂Locostatin进行干预，通过对肝脏炎症及纤维化指标的检测，研究Locostatin能否延缓肝纤维化的进展，甚至预防、阻止肝纤维化形成。 方法:将27只小鼠随机分为正常对照组，模型组，治疗组。治疗组在CCl4诱导小鼠肝纤维化模型过程中，通过腹腔注射Locostatin进行干预。通过检测血清中谷氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase，ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶（aspartate transaminase，AST）的水平及肝脏组织HE染色来研究肝脏炎症程度的变化，通过血清羟脯氨酸(hydroxyproline，HYP)及肝脏组织Masson、苦味酸-天狼星红染色研究胶原的变化。通过实时定量聚合酶链式反应(reverse transcription quantitative PCR，RT-qRCR)分析Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、Ⅳ型胶原、MMP-13、MMP-2、TIMP-1、TIMP-2、RKIP及α-SMA基因水平的表达。通过免疫组织化学(immunohistochemistry, IHC)及western blot方法分析Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、Ⅳ型胶原、α-SMA及RKIP蛋白的表达。运用酶联免疫法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)测定MMP-13、MMP-2、TIMP-1及TIMP-2蛋白的表达量。 结果: 1、Locostatin可以抑制炎症反应，减少HSCs活化及胶原沉积:在HE染色中模型组炎症重于治疗组，正常对照组无炎症反应。在Masson染色及苦味酸-天狼星红染色中模型组胶原含量多于治疗组，正常对照组未见胶原在异常部位的沉积。IHC中模型组Ⅰ、Ⅲ型胶原及α-SMA的表达多于治疗组，正常对照组表达最少。Ⅳ型胶原在模型组表达量最低，治疗组表达量最高。模型组ALT（189.43±64.25）水平明显高于(P＜0.01)正常对照组（8.06±4.46）及治疗组（61.88±5.40）水平，正常对照组与治疗组无显著性差异(P＞0.05)。模型组AST（231.15±39.86）水平明显高于（P＜0.01）正常对照组（39.46±23.11）及治疗组（84.61±29.36）水平，正常对照组与治疗组无显著性差异(P＞0.05)。模型组HYP（3.07±0.47）水平明显高于（P＜0.01）正常对照组（1.63±0.78）及治疗组（2.06±0.83）水平，正常对照组与治疗组无显著性差异(P＞0.05)。 2、Locostatin可以降低Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原及α-SMA mRNA的表达量，增加Ⅳ型胶原及RKIP mRNA的表达量。 2.1 Locostatin可以降低Ⅰ型及Ⅲ型胶原mRNA的表达量:治疗组Ⅰ型胶原mRNA的相对表达量（3.60±0.31）较模型组（9.51±1.37）显著降低(P＜0.01)。治疗组Ⅲ型胶原mRNA的相对表达量（1.25±0.22）较模型组(3.23±0.43)显著降低（P＜0.01）。 2.2模型组中Ⅳ型胶原mRNA表达量减少，Locostatin可以增加Ⅳ型胶原mRNA表达量:模型组Ⅳ型胶原mRNA的相对表达量（0.71±0.21）较治疗组(4.80±1.22)显著降低(P＜0.01)。 2.3模型组TIMP-1、MMP-13、TIMP-2、MMP-2 mRNA的相对表达量（0.84±0.14，0.91±0.02，0.45±0.05，0.73±0.25）较治疗组（0.79±0.13，0.60±0.22，0.49±0.18，0.58±0.16）无明显差异(P＞0.05)。 2.4 Locostatin可以降低α-SMA mRNA表达量:模型组α-SMA mRNA相对表达量(6.73±0.10)较治疗组（2.71±0.31）显著升高（P＜0.01）。 2.5 Locostatin可以增加RKIP mRNA的表达量:治疗组RKIP mRNA的相对表达量（3.49±0.50）较模型组（1.06±0.16）显著升高(P＜0.01)。 3 Locostatin可以降低Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、α-SMA蛋白表达量，增加Ⅳ型胶原、RKIP蛋白表达量。 3.1模型组中Ⅰ型胶原蛋白表达升高，Locostatin可以降低Ⅰ型胶原蛋白表达:治疗组（0.68±0.06）较正常对照组（0.22±0.04）Ⅰ型胶原蛋白的表达量显著增高(P＜0.01)，治疗组Ⅰ型胶原蛋白表达量较模型组（1.37±0.13）明显降低（P＜0.01）。 3.2模型组中Ⅲ型胶原蛋白表达升高，Locostatin可以降低Ⅲ型胶原蛋白表达:治疗组（0.16±0.02）较正常对照组(0.11±0.02)Ⅲ型胶原蛋白的表达量显著增高（P＜0.01），治疗组Ⅲ型胶原蛋白表达量较模型组（0.26±0.07）明显降低(P＜0.01)。 3.3模型组中Ⅳ型胶原蛋白表达量最低，而Locostatin可以增加Ⅳ型胶原蛋白表达:模型组Ⅳ型胶原蛋白相对表达量（0.21±0.04）较正常对照组(0.38±0.07)及治疗组（0.68±0.04）均显著降低(P＜0.01)，正常对照组蛋白相对表达量较治疗组显著降低(P＜0.01)。 3.4模型组中α-SMA蛋白表达增加，Locostatin干预可以减少HSCs的活化，降低α-SMA蛋白的表达:模型组α-SMA蛋白相对表达量（1.54±0.13）比正常对照组（0.42±0.04）及治疗组（0.63±0.06）显著升高(P＜0.01)，治疗组α-SMA蛋白表达量比正常对照组明显升高(P＜0.05)。 3.5 CCl4造模不会影响RKIP的表达，但Locostatin干预可以反应性的引起RKIP表达量升高:治疗组RKIP蛋白的相对表达量（0.82±0.12）较模型组（0.46±0.09）均显著增高(P＜0.01)，正常对照组（0.29±0.05）及模型组RKIP蛋白的相对表达量无明显差异(P＞0.05)。 4、Locostatin通过调节MMP-13及TIMP-1的比值，促进Ⅰ型及Ⅲ型胶原降解。 4.1 CCl4造模可以降低TIMP-1蛋白的表达，Locostatin干预对TIMP-1蛋白含量影响不大:模型组（136.88±39.51）及治疗组（140.39±24.70）TIMP-1的表达量比正常对照组（244.29±74.25）显著降低(P＜0.05)，模型组及治疗组TIMP-1的表达无明显差异（P＞0.05）。 4.2模型组中MMP-13蛋白的表达降低，Locostatin干预对MMP-13蛋白含量影响不大:模型组（23.04±4.05）及治疗组（20.44±5.35）MMP-13的表达比正常对照组（31.96±8.28）明显降低(P＜0.05)，模型组及治疗组MMP-13的表达无明显差异(P＞0.05)。 4.3模型组中TIMP-2蛋白的表达降低，Locostatin干预对TIMP-2蛋白含量影响不大:模型组（8.72±5.17）及治疗组（9.42±3.01）TIMP-2的表达量比正常对照组(18.07±7.18)明显降低(P＜0.05)，模型组及治疗组TIMP-2的表达无明显差异(P＞0.05)。 4.4模型组中MMP-2蛋白的表达降低，Locostatin干预对MMP-2蛋白含量影响不大:模型组（326.42±64.63）及治疗组（342.54±66.73）MMP-2的表达量比正常对照组（700.99±245.48）显著降低(P＜0.01)，模型组及治疗组MMP-2的表达无明显差异(P＞0.05)。 4.5 Locostatin可以促进胶原降解:模型组（0.17±0.02）及治疗组（0.19±0.01）MMP-13/TIMP-1比值较正常对照组(0.13±0.02)显著升高（P＜0.01），模型组MMP-13/TIMP-1比值比治疗组显著降低(P＜0.01)。 4.6正常对照组（0.40±0.07）、模型组（0.39±0.02）及治疗组（0.43±0.03）三组MMP-2/TIMP-2相比，无明显差异（P＞0.05）。 结论: Locostatin可以降低CCl4诱导的肝纤维化小鼠的肝脏炎症程度，这可能是通过Locostatin抑制炎症细胞迁移实现的。其次，Locostatin通过抑制肝星状细胞活化并增加MMP-13与TIMP-1比值，减少了Ⅰ型及Ⅲ型胶原沉积，延缓了肝纤维化进展。