小麦矮腥黑粉菌分子检测体系的建立及侵染循环的观察

• 作 者: 蔚慧欣
• 机 构: 西南科技大学
• 出 处: 西南科技大学
• 发表日期: 2015年期
• 关键词: 小麦矮腥黑粉菌 实时荧光定量PCR 侵染循环 菌丝体 超微结构

小麦矮腥黑粉菌(Tilletia controversa Kühn,TCK)引起的小麦矮腥黑粉病(Wheat dwarf bunt disease,DB)是一种系统侵染性病害,是极难防治的国内外重要检疫性病害之一。在生物学性状上,小麦矮腥黑粉菌与小麦网腥黑粉菌、小麦光腥黑粉菌等多种腥黑粉菌极为相似,采用传统检疫手段难以将其区分。因此,有必要研究开发快速、准确的病害分子检测技术。真菌在寄主体内以菌丝体形式发育为冬孢子完成整个侵染循环,与寄主演化形成和谐互作模式。本试验依据实验室前期筛选TCK独有661bp大小的基因组差异片段设计TCK特异性引物,建立分子检测技术体系同时应用激光共聚焦显微镜和电子显微镜观察研究TCK与寄主互作的细胞学特征和超微结构观察。研究结果如下:1.成功建立了两套常规PCR检测体系,目的条带分别为372、112bp。建立的PCR检测体系特异性强,能扩增出不同菌株的TCK DNA片段,而对Tilletia tritici Tul(TCT)的不同菌株和其他近源种DNA都不能扩增;PCR可检测出模板DNA为1个冬孢子。该特异检测体系,可简单而快速地鉴定小麦矮腥黑穗菌冬孢子或小麦早期组织是否侵染菌丝体。2.建立Taq Man探针法和SYBR Green I荧光染料法Real-time PCR检测体系,两检测体系中对重组质粒的检测灵敏度可达0.1fg,比常规PCR的灵敏度高出2~3个数量级,可用于小麦矮腥黑穗病的早期诊断和小麦矮腥黑穗菌与其近源种小麦网腥黑穗菌的鉴定。3.分别采用两种PCR技术对小麦不同生长期的发病情况进行了动态监测,结果表明检测最早可在一叶期早期检出感病小麦样品的阳性信号。根据定量PCR监测结果分析,侵染菌丝体DNA含量极低,荧光定量PCR检测体系灵敏度高于常规PCR检测体系,更适合于小麦系统侵染性病害的无症样品的早期监测。4.在激光共聚焦显微镜下观察了小麦各生长时期不同组织的侵染过程,人工接种侵染后菌丝体随生长点移动,侵染丝位于各组织胞间隙;花期子房被侵染后花药随之被侵染而无法受精;成熟期旗叶、茎秆部可同时观察到冬孢子和菌丝体出现。5.透射和扫描电镜下观察到在感病早期,侵染后的叶片细胞超微结构发生了显著变化,如质膜内陷和断裂,叶肉细胞畸形、散出,细胞核结构被破坏,细胞器的基质电子密度下降。细胞间隙出现空细胞和纤维状膜状物等。且成熟期根部、茎秆部、子粒和旗叶在扫描电镜下能观察到冬孢子。