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目的:癫痫是儿童临床最常见的神经系统疾病之一,其发病机制仍不清楚。癫痫的发生常伴随着神经发生和血管新生,有研究证实癫痫发作后抑制脑内新生微血管生长有利于控制癫痫的发作。在多种癫痫模型中,哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路均被证实过度激活,mTOR可能通过介导细胞凋亡、炎症反应等多途径调控癫痫的发生发展。内皮-单核细胞激活多肽Ⅱ（EMAPⅡ）是一种能诱导内皮细胞产生组织因子促凝活性,趋化单核细胞和粒细胞诱导炎症反应的蛋白,因其具有抑制肿瘤血管新生的作用而被广泛运用于肿瘤的临床治疗中。研究证实EMAPⅡ可通过mTOR信号通路抑制肿瘤细胞增殖及促进肿瘤细胞凋亡。EMAPⅡ是一种神经毒性损伤的敏感标志物,在多种中枢神经系统疾病中均有特异性改变。缺氧、化疗或细胞凋亡等应激状态下,细胞分泌EMAPⅡ明显增加。研究证实癫痫持续状态（SE）后,脑内存在广泛的血管内皮细胞及神经元的凋亡,且SE的发生可使脑内神经细胞处于缺氧状态。因此,本研究的目的是通过临床样本的蛋白组学筛查来研究惊厥性发作患者体内EMAPⅡ是否存在改变,再结合动物实验研究大鼠发生SE后海马内EMAPⅡ是否出现变化,外源性的EMAPⅡ活性蛋白能否通过抑制血管新生而减轻癫痫发作,并在细胞实验中探讨EMAPⅡ是否通过mTOR信号转导通路来影响大鼠的脑微血管内皮细胞。研究方法:本研究包括临床、动物和细胞实验三部分。1、临床部分包括单纯性热性惊厥（SFS）患儿的血清蛋白质组学研究和颞叶癫痫（TLE）患者的脑组织蛋白质组学研究。选择临床上符合SFS诊断的病例,对照组选择儿科保健门诊健康体检的儿童,采集静脉血清样本。共6对样本,通过高效液相色谱及质谱的方法,筛选出SFS组和对照组间变化明显的差异蛋白,并整理出每种蛋白中变化较为明显的肽段,对其进行平行反应监测（PRM）验证。再选择临床上符合TLE诊断的病例,所有病例均行前颞叶及海马杏仁核切除术,术后采集脑组织标本。共3对标本,通过高效液相色谱及质谱的方法,筛选出TLE组和对照组间变化明显的差异蛋白。2、动物部分采用匹鲁卡品腹腔注射建立大鼠SE模型,并对SE大鼠进行脑电监测。于SE后2h、24h、3d、7d、14d和21d这6个时间点取材,每个时间点均设相应的对照组,造模时予生理盐水等体积腹腔注射。造模及取材时测量各组大鼠的体重;应用HE染色观察各时间点海马区血管的病理改变;透射电镜观察血管内皮细胞的超微结构;采用免疫荧光双染定位EMAPⅡ在大鼠脑内的表达;通过免疫荧光、western blot和RT-PCR分别检测大鼠海马EMAPⅡ、CD31和紧密连接蛋白ZO-1、Occludin的蛋白和mRNA的表达情况。另外,再选取SD大鼠随机分成对照（Ctr）组、癫痫（SE）组、EMAPⅡ组和EMAPⅡ+Oligomycin组。匹鲁卡品造模同前,对照组给予等体积的生理盐水腹腔注射,后三组分别于腹腔注射匹鲁卡品造模1.5小时前通过侧脑室给药的方式分别予大鼠ddH2O、EMAPⅡ、EMAPⅡ+Oligomycin。观察24h内大鼠的抽搐次数,于SE后24h取材。透射电镜观察血管内皮细胞的超微结构;通过免疫荧光和western blot分别检测大鼠海马CD31和紧密连接蛋白ZO-1、Occludin以及p-mTOR、mTOR的蛋白的表达情况。3、细胞部分选取1-3d新生大鼠脑提取原代血管内皮细胞。取脑后分离大脑皮质,剪碎后通过消化、离心、重悬、连续密度梯度离心等步骤收集微血管段,再接种于多聚赖氨酸预先包被的培养皿中,37℃、5%CO2恒温箱中培养,定期换液传代。取原代细胞用CD31免疫荧光鉴定血管内皮细胞。选取生长状态良好的3代以内的血管内皮细胞,随机分为对照（Ctr）组、癫痫（Epilepsy）组、EMAPⅡ组、EMAPⅡ+Rapamycin和EMAPⅡ+MHY1485组,分别置于常规培养液中48h、无镁培养液中48h、无镁培养液中48h+EMAPⅡ作用24h、无镁培养液中48h+EMAPⅡ+Rapamycin作用24h、无镁培养液中48h+EMAPⅡ+MHY1485作用24h。光镜下观察各组细胞的生长状态;CCK-8法检测各组细胞的细胞增殖活性;western blot检测各组细胞CD31、Occludin和ZO-1蛋白的表达。结果:1、从SFS血清标本中共筛查出698种蛋白,567种蛋白至少在三对以上样本中表达,约占所有筛查蛋白的81%;567种蛋白中有统计学差异的蛋白共86种,其中51种蛋白在SFS组中减少,35种蛋白在SFS组中增加;其中有38种蛋白的P值低于0.001;变化最显著的两种蛋白(P<10-6)是纤维蛋白原-β链（FGB）和纤维蛋白原-γ链（FGG）,两者在SFS组中均下降98%以上;将其中10种蛋白进行PRM验证,其中纤维蛋白原α链（FGA）、FGB、FGG三种蛋白下降最明显（P<0.01）;EMAPⅡ在所有血清样本中均未检测到。2、从TLE脑组织标本中共筛查出5083种蛋白,其中3278种蛋白在三对脑组织标本中均有表达,3873种蛋白在至少2对脑组织标本中有表达;将3873种蛋白进行分析,发现TLE组与对照组相比,493种蛋白有2倍以上的改变;EMAPⅡ在三组TLE样本中都较对照组升高。3、正常状态下,EMAPⅡ在海马各区少量表达,SE后EMAPⅡ主要表达在神经元的胞浆和血管周围细胞内。SE后2h时EMAPⅡ表达明显增加（P<0.001）,至7d时EMAPⅡ蛋白增加最明显（P<0.001）,后逐渐下降,SE后21d时仍明显高于对照组（P<0.001）。4、SE后2h时CD31蛋白表达显著增加（P<0.001）,至3d时CD31蛋白增加达高峰（P<0.001）,再逐渐下降,至SE组21d时仍明显高于对照组（P<0.001）。5、与同时间点的对照组相比,SE组各时间点ZO-1和Occludin蛋白表达均明显减少;SE后2h时ZO-1蛋白表达减少最明显（P<0.001）,随后逐渐增加,至14d时ZO-1蛋白表达仍低于对照组（P<0.05）;SE后2h时Occludin蛋白表达减少最明显（P<0.001）,后逐渐增加再逐渐减少。6、与SE组相比,EMAPⅡ组大鼠抽搐强度明显减弱（P<0.01）,24小时内的抽搐次数明显减少（P<0.001）;EMAPⅡ+Oligomycin组较EMAPⅡ组大鼠的抽搐强度增强（P<0.05）,24小时内的抽搐次数增加（P<0.001）;EMAPⅡ组大鼠24小时内未见死亡,EMAPⅡ+Oligomycin组大鼠24h内大鼠死亡率约10.8%。7、与SE组相比,EMAPⅡ组CD31蛋白表达减少（P<0.05）;与EMAPⅡ组相比,EMAPⅡ+Oligomycin组CD31蛋白表达显著增加（P<0.01）。8、与SE组相比,EMAPⅡ组紧密连接蛋白ZO-1和Occludin表达明显增多（P<0.001）;与EMAPⅡ组相比,EMAPⅡ+Oligomycin组ZO-1和Occludin蛋白表达显著减少（P<0.001）。9、无镁液处理48h,给予mTOR抑制剂Rapamycin处理后,EMAPⅡ抑制内皮细胞生长的作用明显加强（P<0.05）,紧密连接蛋白ZO-1和Occludin表达明显增加（P<0.05）;给予mTOR激动剂MHY1485处理后,EMAPⅡ抑制内皮细胞生长的作用明显减弱（P<0.05）,紧密连接蛋白ZO-1和Occludin表达减少（P<0.05）。结论:1、SFS病例凝血系统通路所涉及的纤维蛋白原相关蛋白明显下降,纤维蛋白原相关蛋白可能参与SFS的病理生理过程;2、TLE病例脑组织EMAPⅡ表达较对照组升高,EMAPⅡ可能参与癫痫的发生发展;3、SE后EMAPⅡ和内皮细胞特异性抗原CD31表达明显上升,紧密连接蛋白Z0-1和Occludin表达明显下降,三者可能存在一定关联;4、外源性注射EMAPⅡ可以抑制SE大鼠脑海马区血管新生,改善血管内皮的紧密连接;5、EMAPⅡ可能是通过mTOR信号通路来抑制血管内皮细胞的增殖,调节其紧密连接。