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猪链球菌(Streptococcussuis,S.suis)是重要的人兽共患病病原体,可引起人和猪患脑膜炎、关节炎、肺炎、败血症甚至急性死亡,给养猪业和从业人员健康均带来巨大威胁。1998年和2005年,在我国江苏省和四川省分别暴发了S.suis2感染人和猪的公共卫生事件,患者中出现国内外罕见的链球菌中毒性休克综合征(STSS)症状,该疫情引起了公共卫生领域的高度重视。虽然疫苗的研制是控制S.suis感染的重要手段,但是目前尚未开发出用于预防S.suis感染的有效疫苗。
ABC转运蛋白在细菌适应外界环境变化中具有一系列不同的功能,为细菌输入生存所必需的营养物质,输出有毒物质。ABC转运蛋白在一些病原菌的致病过程中起到重要的作用,而且许多定位于细菌表面的ABC转运蛋白具有免疫原性和免疫保护性。因此,ABC转运蛋白在疫苗开发中具有潜在的价值。锌是细菌生长所必需的一种重要微量元素,锌的吸收对于细菌在外界环境和宿主体内的生存、繁殖至关重要。在细菌中,锌ABC转运蛋白ZnuABC不仅参与锌的运输,还在多种病原菌的致病过程中起到非常重要的作用。
本研究通过生物信息学分析,发现S.suis2中国强毒株05ZYH33基因组中存在ZnuABC编码基因,其中细胞表面锌离子结合蛋白znuA与多种细菌的锌锰离子结合脂蛋白具有较高的序列同源性。以S.suis2中国强毒株05ZYH33基因组为模板,PCR扩增znuA基因并克隆到pET32a载体并转化到E.coli,原核表达出ZnuA,并利用His亲和层析获得较高纯度的重组蛋白。Westernblot分析和ELISA结果表明,ZnuA具有良好的免疫原性,是一种在S.suis2感染过程中表达的蛋白。流式细胞术结果表明,ZnuA是一个S.suis2菌体表面蛋白。动物实验结果表明,ZnuA重组蛋白对BALB/c小鼠具有良好的免疫保护作用,ZnuA可作为一个预防S.suis感染的亚单位疫苗候选分子。此外,基于ZnuA重组蛋白,初步建立了S.suis2感染的血清学检测方法。
本课题组前期研究发现一个全局性毒力负调控因子CovR,CovR调控多个毒力相关基因的表达,其中溶血素样蛋白基因hlp的表达发生上调。本研究的第二部分,首先从05ZYH33基因组中扩增基因hlp,构建重组表达质粒pET32a::hlp,转化E.coliBL21(DE3),原核表达出Hlp重组蛋白。His亲和层析获得较高纯度的Hlp重组蛋白后,利用重组蛋白免疫新西兰兔,获得较高效价的抗血清。
以上研究结果为进一步开展ZnuA和hlp在S.suis致病过程中的作用机理研究及S.suis疫苗的研究奠定了基础。