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杆状病毒表达载体系统是八十年代发展起来的真核表达系统,昆虫细胞具备所有真核系统翻译后加工功能,如二硫键的形成、糖基化、磷酸化、信号肽切除等,表达出的重组蛋白具有天然蛋白的生物学功能。但是昆虫细胞培养条件苛刻,无法大规模发酵生产,成本较高。相比之下,家蚕饲养方式简单经济,其成本为细胞培养的1/10,而蛋白表达量则为其10倍左右。因此利用杆状病毒在家蚕体内经济高效地表达外源蛋白具有良好的应用前景。
目前重组病毒都是包涵体缺陷型,无法以喂食的方式感染家蚕,只能以手工的方式将重组病毒注射到家蚕幼虫血腔内来实现感染,但手工注射操作感染效率低,并且繁琐,极大地限制了外源蛋白大大规模生产。为来改变这一传统操作手段,首先要得到在细胞或者家蚕幼虫中稳定表达多角体基因的拯救细胞系,重组病毒感染拯救细胞系时细胞中已有多角体蛋白,因此病毒增殖时能直接装配成包涵体病毒。拯救的重组病毒包涵体通过口服感染家蚕幼虫时其基因组中没有多角体基因,无法表达多角体和再次形成包涵体病毒,只能以出芽型病毒粒子进行水平传播和感染,而外源基因依然得到高效表达。实验分成以下几部分来完成。
1、构建鳞翅目转座辅助载体pIE2-piggyBac。构建家蚕Bombyxmori肌动蛋白(BmA3)启动子驱动的家蚕核型多角体病毒(BmNPV)多角体基因(ph)和OpNPV极早期启动子(IE1)驱动的zeocin抗性筛选基因转座供体载体pBac-A3ph-IE1zeo。
2、转座供体载体pBac-A3ph—IE1zeo和转座辅助载体pIE2-piggyBac共转染家蚕卵巢细胞BmN,经含终浓度为200μg/mLzeocin抗生素的TC-100完全培养基筛选一个月,成功获得持续表达BmNPV多角体蛋白的稳定细胞系BmN-A3ph。
3、用多角体缺陷型重组病毒BmBac-GFP感染拯救细胞系BmN-A3ph,激光共聚焦显微镜观察,结果显示BmBac-GFP感染的稳定细胞系BraN-A3ph不仅细胞为绿色,并且观察到明显的多角体颗粒,其包装效率为野生型病毒感染正常BmN细胞的8％。
4、用105/ml_拯救型包涵体病毒颗粒喂食3龄家蚕幼虫,7天后发现部分家蚕幼虫出现病毒感染的典型症状,虫体呈绿色,10天后所有家蚕幼虫全部变成绿色。显微镜下观察,血淋巴细胞发出绿色荧光蛋白,但细胞内并无多角体出现。