滑菇（pholiota namek）漆酶的诱导、纯化、cDNA克隆及表达

• 作 者: 周蕊
• 机 构: 南京林业大学
• 出 处: 南京林业大学
• 发表日期: 2007年01期
• 关键词: 漆酶 白腐菌 滑菇 基因克隆 RACE 基因表达 分离纯化

漆酶是一种含铜的多酚氧化酶，广泛存在于真菌中。它可以降解木质素和许多酚类有毒物质，在造纸、环保方面具有广泛的应用前景。本文以白腐担子菌滑菇的漆酶为研究对象，对它进行了培养条件、分离纯化、克隆和外源表达等方面的研究。 采用国内外文献中常用的A、B、C、D四种产酶培养基对滑菇进行产酶培养，通过多批次多平行样的培养，得出D培养基不仅酶活高而且成分最清楚，是四种培养基中的最佳产酶培养基：以D培养为基础改变碳氮源比例，设计HNHC、HNLC、IMHC、LNLN四种培养基，对四种培养基进行诱导产酶比较，得出HNHC培养基为最佳诱导培养基；以HNHC为基础，改变培养基中的氮源，分别使用硝酸铵，天冬酰胺，尿素，酵母浸膏为氮源，得出天冬酰胺为最佳氮源。 在培养基中加入锰离子和铜离子至终浓度为0.05mmol/L-8mmol/L，经过间隔取样可知：低浓度的铜离子(小于1mmol/L)可以诱导滑菇漆酶产生，高浓度的铜离子(大于1mmol/L)抑制滑菇漆酶的产生。低浓度的锰离子(小于等于1mmol/L)对滑菇漆酶的产生影响较小，虽没有促进作用，但也几乎没有抑制作用。高浓度的锰离子(大于等于1mmol/L)明显的抑制滑菇漆酶的产生。 采用离子交换柱层析和分子筛这两种分离纯化方法对粗酶液进行分离纯化，所得到的蛋白用SDS-PAGE检验。粗纯化蛋白的最适反应pH为5.5，最适反应温度为55℃，在40℃到60℃时的热稳定性较高，大于60℃时酶活损失严重。 根据漆酶的四个铜离子结合位点的保守性，设计简并性引物，RT-PCR得到滑菇漆酶eDNA片段。使用SMART RACE cDNA Apmlification Kit得到完整的漆酶cDNA基因。漆酶cDNA长1733bP,编码区为1542bp,编码了514个氨基酸，前18个氨基酸是信号肽，并且有多种限制性内切酶的酶切位点。理论等电点为5.52，理论分子量为56952.90Da。 使用Invitrogen的EasySelect Pichia Expression Kit对漆酶cDNA基因进行外源表达，载体为pPICZαB，宿主菌为KM71H(Mut，Arg<+>)。转化得到的阳性克隆分别采用活性平板培养和摇床诱导产酶培养检测，虽然多种验证证实滑菇漆酶基因已经整合到酵母基因组DNA中，但是无活性的漆酶产生说明表达还存在着复杂的问题。