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湖泊蓝藻水华已成为威胁淡水生态系统安全的一个严重因子,但由于目前对蓝藻水华暴发规律的研究尚没有取得突破性进展,使得蓝藻水华的预警和控制还面临巨大挑战。为此,本论文从生态安全的观念出发,通过对太湖水中溶藻细菌的分离、鉴定和溶藻活性的研究,为太湖蓝藻水华的生物控制提供新的途径和措施。
同时,为了找出影响淡水系统蓝藻水华的因子,我们利用实时荧光定量PCR技术,检测了太湖溶藻细菌R219、总细菌与水华微囊藻种群数量的变化关系,并分析了影响溶藻细菌与微囊藻种群消长的环境因子。取得的主要结果包括:
(1)通过对太湖水样的逐月分离,共获得42株细菌,其中5株对太湖优势水华蓝藻铜绿微囊藻的生长有很强的抑制/杀死作用;根据形态学观察、生理生化测定和16S rRNA基因序列分析,它们分别为恶臭假单胞菌(Pseudomonas putidaR3)、代尔夫特菌(Delftia sp.R5)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus R6)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae R13)和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa R219),其中R219的溶藻活性最高。
(2)用不同数量的溶藻细菌R219与铜绿微囊藻混合培养,当菌藻细胞数量比达46:1,R219对铜绿微囊藻的抑制率达到98%。平板溶藻实验结果表明,R219通过分泌胞外代谢产物而起溶藻作用;液体培养R21972h,溶藻活性高达81%;R219产生的溶藻活性物质可以用乙酸乙酯萃取,所得萃取浸膏具有很好的热稳定性,100℃处理30min,溶藻活性仍高达58%;此外,萃取浸膏对处于不同生育阶段,不同细胞密度的铜绿微囊藻均有很高的溶藻活性。采用硅胶柱层析和LC-MS等分离鉴定技术,初步证明R219产生与已报道的铜绿假单胞菌产生的溶藻活性物质-1-羟基吩嗪不同的新化合物。
(3)R219具有较广的溶藻谱,用浓度为20μg/ml的萃取浸膏处理铜绿微囊藻(Microsystis aeruginosa)、水华微囊藻(Microsystis flos-aquae)、惠氏微囊藻(Microsystis wesenbergii)、鱼腥藻(Anabaena sp.)和柯氏并联藻(Quadrigulachodatii),溶藻率可达70-80%,但对水华束丝藻(Aphanizomenon flos-aquae)的溶藻活性较低,为42%。室内模拟R219对太湖水华的控制作用,用R219的发酵液以及发酵液滤液处理从太湖水华混合藻,藻的叶绿素含量降低80-90%,表明R219可用于太湖水华的控制。
(4)用R219发酵液及发酵液滤液进行小鼠灌胃实验,使用剂量为0.5 g kg-1和2.0g kg-1,在试验周期的14天内没有出现任何行为上的病症,表明R219毒性较低或无毒。
(5)采用实时荧光定量PCR技术,研究了溶藻细菌R219与太湖水华优势蓝藻一微囊藻(Microcystis)种群的原位消长规律,发现溶藻细菌R219的发生高峰滞后于微囊藻。逐步回归统计分析表明,太湖有数水华微囊藻的种群消长与水中R219(ABR)、总细菌种群量(TB)和ABR/TB以及氮含量和温度等显著相关。上述研究结果国内外未见报道。
基于溶藻活性、溶藻谱、小鼠急性毒性、室内模拟水华控制实验以及与微囊藻种群消长相关性的原位检测结果,表明溶藻细菌R219在太湖淡水生态系统中起重要调控作用,并可用于太湖蓝藻水华的治理以及早期预警。