胡萝卜高效遗传转化体系的建立及遗传稳定性的研究

• 作 者: 郭蓉
• 机 构: 甘肃农业大学
• 出 处: 甘肃农业大学
• 发表日期: 2005年01期
• 关键词: 轮状病毒 VP4、6、7 基因 胡萝卜 农杆菌 遗传转化

轮状病毒是世界范围内引起婴幼儿病毒性腹泻的主要病原体,尤其在发展中国家,每年受轮状病毒危害的婴幼儿数量非常巨大。目前,对轮状病毒感染最有效的预防和控制措施,仍是注射疫苗。VP4 和VP7 是轮状病毒的主要外壳蛋白和中和抗原,VP6 是主要的病毒蛋白,能诱导产生IgG 抗体和IgA 抗体,与保护性免疫有关。这三个基因片段是发展基因工程疫苗的首选。　本试验以胡萝卜下胚轴为受体材料,通过农杆菌介导法将轮状病毒片段基因VP4、VP6 和VP7 转入胡萝卜中,对胡萝卜转化体系中的一些关键性的步骤进行了条件优化,如:下胚轴的浸染时间、共培养时间、Kan 敏感试验、Cab 和Cef 的对比试验等对转化的影响,建立了高效的胡萝卜遗传转化体系。主要研究结果如下:　1.用农杆菌浸染7～9　d 苗龄的胡萝卜下胚轴约15　min,共培养2～3　d 后,转入B5附加75　mg/L　Kan+500　mg/L　Cab 的愈伤诱导培养基上,待形成抗性愈伤后,继代到B5附加100　mg/L　Kan　+　500　mg/L　Cab 的抗性芽诱导培养基上,当苗长至2～3　cm 时,转入B5附加　0.1　mg/L　IBA　+　75　mg/L　Kan　+　300　mg/L　Cef 的生根培养基上,2～3 周后可得到Kan 抗性苗。　2.　经过几次Kan 的筛选,得到Kan 抗性植株408 棵,并对其进行PCR 检测。其中156 棵转VP6 基因的Kan 抗性植株,有58 棵为PCR 阳性,阳性率达到37.2　% ;172棵转VP7 基因的Kan 抗性植株,有84 棵为PCR 阳性,阳性率达到48.8　%;80 棵转VP4 基因的Kan 抗性植株,有31 棵为PCR 阳性,阳性率达到38.8　%。　3. 用塑料布覆盖并逐渐打开通风口方法炼苗,抗性植株长势好,抗性强,成活率提高了35　%。低温春化,试验大棚和陆地相比,死亡率降低了49.5　%。　4.　对T0代转VP6 和VP7 基因的植株经RT-PCR 检测初步证明了VP6、VP7　基因的转录。对T1代转VP6和VP7基因的植株分别进行了PCR、PCR-Southern　blot和Southern　blot 检测,证明目的基因已经整合到胡萝卜基因组上。　5. 对7 个株系T1代植株的PCR 分析,得出其中两株系接近1:1,另两株系为1:3。