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随着糖尿病慢性并发症研究的不断深入,血糖波动在糖尿病并发症中所起的作用受到越来越多人的重视。大量临床研究表明,糖尿病的预后及慢性并发症的发生和发展不仅与整体血糖水平的升高密切相关,而且与患者的血糖波动有密切关系。糖尿病患者血糖波动越大,慢性并发症的发生率越高、预后就越差。但是目前血糖波动致使糖尿病慢性并发症的具体机制尚未阐明。本实验室前期研究工作发现:血糖波动会导致小鼠各个脏器、离体培养的肾小球系膜细胞和血管内皮细胞发生不同程度的氧化损伤。为了从在体和离体水平深入研究血糖波动致使糖尿病慢性并发症的机制,本研究旨在通过建立灵敏、准确、可靠的血糖波动小鼠模型,从糖尿病慢性并发症的发病机制:多元醇通路(PP)途径、氧化应激(OS)途径、晚期糖基化终末产物(AGEs)途径和一些细胞因子表达入手,较为系统地研究葡萄糖浓度波动对小鼠主要脏器(肝脏、肾脏)及牛血管内皮细胞损伤的机制,并初步探讨血糖波动与糖尿病慢性并发症之间的关系——这方面的研究目前未见相关文献报道。本文从三个方面开展研究,包括:一、血糖波动动物模型建立:建立血糖波动小鼠模型,比较血糖波动对正常小鼠与糖尿病小鼠的影响,便于进一步研究血糖波动对小鼠脏器的损伤机制及其与糖尿病并发症之间的关系。实验分四组:正常对照组(N)、正常波动组(F)、糖尿病模型组(DM)和糖尿病波动组(DM+F)。F组和DM+F组每天三次腹腔注射0.4mL 250g/L的葡萄糖溶液,来构建血糖波动小鼠模型;同时,N组和DM组腹腔注射0.4mL生理盐水作为对照,监测1d内各组小鼠的血糖变化。4w后检测空腹血糖(FPG)、空腹胰岛素(FINS)、果糖胺(FA)和糖耐量水平,并计算胰岛素抵抗指数(IR)、胰岛素敏感指数(IAI)、胰岛β细胞功能指数(HBCI)和空腹β细胞功能指数(FBCI)。结果表明,F组和DM+F组的血糖于1d内呈现明显波动,4w后F组FPG显著高于N组(P＜0.001)、DM+F组的FPG高于DM组;F组和DM+F组的FA水平与N组和DM组相比明显升高,差异极显著(P＜0.001);F组和DM+F组小鼠糖耐量受损严重。与N组相比,DM组和DM+F组出现胰岛素抵抗加剧及胰岛素敏感指数大幅下降等症状,DM+F组的趋势更为明显。可见腹腔注射葡萄糖溶液能够建立灵敏、准确、可靠的血糖波动小鼠模型。二、在体水平研究:通过建立血糖波动小鼠模型,研究血糖波动对小鼠肝脏、肾脏的损伤机制及其与糖尿病并发症之间的关系。实验分四组:正常对照组(N)、正常波动组(F)、糖尿病模型组(DM)和糖尿病波动组(DM+F)。建立血糖波动小鼠模型,4w后检测肝脏、肾脏中如下指标并同时进行血管通透性实验:1、多元醇通路途径相关指标:生化法测定眼球和肾脏中山梨醇含量、肾脏中醛糖还原酶(AR)和山梨醇脱氢酶(SDH)含量。2、氧化应激途径相关指标:生化法测定肝脏、肾脏中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)和丙二醛(MDA)的含量。3、晚期糖基化终末产物途径相关指标:荧光分光光度法和Elisa法测定肝脏、肾脏AGEs含量;SDS—PAGE电泳观察肝脏、肾脏总蛋白表达情况;Rt-PCR检测肝脏、肾脏晚期糖基化终末产物受体(RAGE)mRNA的表达情况。结果发现,血糖波动能显著增加眼球和肾脏组织内山梨醇含量(P＜0.01和P＜0.001);在肾脏中,AR含量升高、SDH含量明显下降(P＜0.05)。波动组小鼠SOD和GSH含量显著低于对照组,而MDA含量明显高于对照组(P＜0.01和P＜0.001)。研究表明,血糖波动对小鼠肝脏、肾脏的氧化损伤更为明显。波动组小鼠肝脏、肾脏组织内AGEs累积显著高于对照组(P＜0.05和P＜0.001),同时RAGE的mRNA表达上调(P＜0.01和P＜0.001)。肝脏、胰脏、肾脏、心脏和大脑等器官血管通透性更为严重。三、离体细胞水平研究:研究葡萄糖浓度波动对牛血管内皮细胞的损伤机制及其与糖尿病并发症之间的关系。实验分三组:正常对照组(N)、高糖损伤组(H)和波动损伤组(F)。波动损伤组的细胞通过有规律地改变培养液中葡萄糖的浓度高低来建立血糖波动的环境,并于48h后进行如下观察与指标检测:1、常规细胞学观察与检测:细胞形态结构观察;MTT法测定细胞存活率;丫啶橙染色荧光显微镜观察细胞存活情况;流式细胞术分析细胞DNA含量;荧光偏振法检测细胞膜的流动性。2、多元醇通路途径相关指标:生化法测定细胞内山梨醇、醛糖还原酶(AR)和山梨醇脱氢酶(SDH)含量。3、氧化应激途径相关指标:生化法测定细胞内超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)和丙二醛(MDA)的含量。4、晚期糖基化终末产物途径相关指标:荧光分光光度法测定细胞内AGEs含量;Cell-Elisa法和流式细胞术检测细胞表面RAGE的表达情况;SDS—PAGE电泳观察细胞总蛋白表达情况;Rt-PCR检测细胞RAGE mRNA的表达情况。5、细胞因子表达方面:酶法测定细胞NO分泌量;Rt-PCR检测细胞一氧化氮合酶(eNOS)和内皮素—1(ET-1)mRNA的表达情况。结果表明,H组和F组细胞形态出现明显改变,与N组相比呈现凋亡趋势,且细胞存活率和细胞膜流动性显著降低(P＜0.05和P＜0.001)。H组和F组细胞内山梨醇、AR和MDA含量显著高于N组(P＜0.01和P＜0.001),但SDH、SOD和GSH含量却明显下降(P＜0.05和P＜0.01)。H组和F组细胞内AGEs含量及细胞表面RAGE表达都显著高于N组(P＜0.001),F组与H组相比也出现极显著差异(P＜0.01和P＜0.001)。H组和F组细胞的RAGE mRNA、eNOS mRNA和ET-1 mRNA表达均上调(P＜0.01和P＜0.001)。通过在体实验和离体细胞实验,综合上述结果我们可以得出如下结论:1、腹腔注射葡萄糖溶液能够建立灵敏、准确、可靠的血糖波动小鼠模型。2、血糖波动能明显加重糖尿病小鼠的病情,并对正常小鼠和糖尿病小鼠的肝脏、肾脏造成严重损伤。血糖波动可能是导致糖尿病肝脏、肾脏并发症发生的原因之一。3、葡萄糖浓度波动能促进血管内皮细胞凋亡、增加细胞膜的通透性,并且促进血管收缩因子及舒张因子的过量分泌,最终导致血管内皮细胞损伤和功能紊乱。研究表明,葡萄糖浓度波动带来的危害要比持续高糖更为严重。这提示我们,血糖波动可能是导致糖尿病血管并发症发生的原因之一。4、糖尿病慢性并发症的发生发展可能是多元醇通路途径、氧化应激途径、AGEs途径和细胞因子表达协同作用的结果,但血糖波动很可能是导致糖尿病慢性并发症发生的始发因素。