论文部分内容阅读
石杉碱甲是目前治疗老年痴呆症的理想药物,随着老年痴呆症患者的不断增加,石杉碱甲的市场需求日益增大。但是,石杉碱甲基本上都来源于蕨类石杉科植物,这类植物具有繁殖能力弱、生长周期长和生长量小等特点,严重制约着石杉碱甲的市场来源,因此解决其原料矛盾成为当前研究热点。本研究以蛇足石杉和本实验室人员分离到的产石杉碱甲蛇足石杉内生真菌Colletotrichum gloeosporioidesES026为研究对象,通过优化石杉碱甲提取、检测和活性检测方法,对C.gloeosporioides ES026所产石杉碱甲进行研究,并采用摇瓶发酵的方法对C.gloeosporioides ES026发酵条件和培养基组分进行了优化。旨在为利用C.gloeosporioides ES026扩大生产石杉碱甲奠定基础,并为同行研究提供参考。本研究工作主要包括如下几个内容：1. C. gloeosporioides ES026中石杉碱甲提取方法的建立。以蛇足石杉为研究对象,采用单因素和正交试验分析的方法对其体内HupA的提取方法进行了分析。优化后的提取方法能够在5 h内完成HupA的分离提取。其中采用乙醇预处理30 min,然后0.5%盐酸浸泡结合分段短时超声处理和CHC13抽提2次的方法最为合适,使HupA的提取率平均达到156.83μg·g-1 dw,是常规提取方法的1.90倍。实验结果表明该方法同样适合C. gloeosporioides ES026中HupA的提取。该方法既节约了时间,又提高了提取率,同时降低了试验成本和环境污染,比较适合实验室研究水平HupA的提取。2.高效液相色谱(HPLC)法检测C. gloeosporioides ES026总生物碱中石杉碱甲方法的建立。本部分试验采用单因素分析的方法,先以蛇足石杉植物体内总生物碱中HupA为检测对象,再对ES026中总生物碱的检测分析,优化出HPLC检测分析ES026总生物碱中HupA的方法为：柱温,40℃；上样体积,20 μL；流速,1.0mL/min;流动相,甲醇：80 mM醋酸铵(pH6.0)=3.5：6.5(v/v)；检测时间,30 min；检测波长,310 nm。该方法既实现了ES026总生物碱中HupA的灵敏检测,又在一定程度上避免了因总生物碱中其它成分没有及时流出导致的色谱柱损伤。3.石杉碱甲对乙酰胆碱酯酶活性抑制试验条件的建立。在参照文献的基础上,采用单因素分析的方法,以HupA标准品为材料试验分析了反应温度、酶浓度和底物使用量等对乙酰胆碱酯酶活性抑制效果的影响。体积为200 μL的反应体系中,乙酰胆碱酯酶活性抑制试验的反应条件为：0.1 M pH7.2磷酸缓冲液,60 μL；0.1 MATCh,20 μL; 1U/mL AChE,10 μL;待测物质：10 μL; 10mM DTNB,100 μL;反应温度,25℃；反应时间：10-30 min。4. C. gloeosporioides ES026产HupA的发酵研究。以本实验室筛选到的产HupA的蛇足石杉内生真菌C. gloeosporioides ES026为研究对象,尝试了不同的发酵条件和培养基组分对C. gloeosporioides ES026中HupA产量的影响。优化后的发酵条件为：发酵温度,25℃；发酵时间,6天；摇瓶转速,150 r/min;装液量,1：5；接种量,2%；光照时间：9 h/24h。这些参数可使C. gloeosporioides ES026中HupA产量提高28.58%。C. gloeosporioides ES026产HupA最适发酵液组分为：土豆水煮液,200 g/L；蔗糖或葡萄糖：10 g/L。在发酵液中添加0.5-2.0%体积的乙醇能刺激ES026菌丝的生长,而同样处理的甲醇对菌丝生长则表现出轻微地抑制作用。然而,甲醇或乙醇都能大大提高C. gloeosporioides ES026中HupA产量,其中乙醇处理的产量提高最多(增量为51.89%)。进一步的分析表明甲醇和乙醇是HupA产量的强诱导剂,而乙醇在发酵过程中能被C. gloeosporioides ES026当做碳源利用。同时还发现用来提取HupA的菌丝球颜色显示出略有差异,其中乙醇处理的菌丝球的颜色能和对照一样逐渐变黑,而甲醇处理的菌丝球则保持浅咖啡色。本研究揭示了对发酵过程进行优化的重要性,再结合有效的诱导剂,可以最大限度地提高内生真菌所产具有重要经济效益的化学物质的产量。5. C. gloeosporioides ES026菌种保存及复壮。内生真菌与其宿主在长期的协同生长中形成了独特的代谢机制,当脱离宿主后,菌体的某些特征将出现衰退现象。本研究采用多种方案进行菌种复壮并有效减缓了C. gloeosporioides ES026衰退速度。①优化其培养条件；②将菌种接种于含有植物醇提液或水提液的斜面培养基中,同时采用营养贫乏(只含0.5%碳源和100 g/L土豆水煮液)和营养丰富的培养基(含1.5%碳源和200 g/L土豆水煮液)交替培养进行短期(4℃)保存菌种；③尽可能地减少其传代次数；④将其反接于宿主植物体中复壮。6. C. gloeosporioides ES026发酵生理特征研究。采用随机取样的方法对ES026发酵过程中的生理特征进行了研究,得到了水溶性总糖、水溶性总蛋白、超氧化物歧化酶、多酚氧化酶和过氧化物酶等的变化趋势,以期为ES026的进一步发酵研究积累数据,也为其它内生真菌发酵生理特征研究提供参考。