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禾谷类作物胚乳富含淀粉,是种子的主要贮藏组织。淀粉分支酶(SBE)是淀粉合成的关键酶之一,主要参与支链淀粉分支侧链的合成。在禾谷类作物胚乳中抑制SBE活性可以提高抗性淀粉含量,但伴随形成异形淀粉和双相淀粉。虽然异形淀粉的结构和发育已被报道,但双相淀粉的结构和发育还鲜为人知。本研究以抑制SBE的玉米和水稻为材料,研究双相淀粉的结构和发育过程,查明双相淀粉粒内部与外部结构的差异,揭示双相淀粉形成和胚乳区域性分布的发育原因。研究结果将有助于高抗性淀粉作物的选育,也为高抗性作物淀粉的开发和应用提供参考资料。主要研究结果如下:1.淀粉结构特性分析方法的建立。为了深入查明淀粉的形态结构和结构特性,本研究建立了禾谷类胚乳淀粉生长环的原位观察方法、淀粉傅立叶变换衰减全反射红外光谱(FTIR)样品制备的简易装置和方法、淀粉小角X射线散射(SAXS)波谱的定量作图分析方法。结果表明,淀粉生长环的原位观察方法可以广泛用于禾谷类胚乳淀粉生长环结构的研究,FTIR样品制备的简易装置和方法可以用于含水淀粉表面有序结构的检测,SAXS波谱的图形分析方法可以定量测定淀粉的片层结构参数。这些方法操作简便,重复性好,使用范围广,为本研究淀粉结构特性的分析提供了技术保障。2.玉米sbe2b突变体胚乳淀粉的形态结构和结构特性。本研究以常规玉米Mo17和sbe2b突变体AF11为材料,分析了胚乳淀粉的形态结构和结构特性。AF11中SBEIIb基因的第九个外显子缺失,导致其淀粉含量显著低于Mo17,可溶性糖含量显著高于Mo17。Mo17淀粉呈现圆球形和多角形,表现为A-型晶体淀粉;而AF11淀粉呈现出大量的多聚体和细长形,表现为B-型晶体淀粉。与Mo17淀粉相比,AF11淀粉具有更高的直链淀粉含量、支链淀粉长分支侧链比例和表面结构有序度,更低的结晶度、片层峰强度和更小的片层距离。上述结果表明,SBEHb基因的突变显著改变了淀粉的形态结构和结构特性,为接下来进一步研究双相淀粉的结构和发育提供了参考。3.玉米sbe2b突变体胚乳双相淀粉的结构特性。本研究以玉米sbe2b突变体AF11为材料,利用形态观察和理化测定等技术方法,分析了双相淀粉的结构特性。AF11胚乳中双相淀粉粒的外部为疏松的梳状凸起结构,无生长环和偏光,碘液染色呈红色;内部为致密的具有生长环的晶体结构,有偏光,碘液染色呈蓝色。双相淀粉主要分布在AF11籽粒冠部胚乳的内部区域。与外部胚乳组织(OE)相比,AF11内部胚乳组织(IE)的直链淀粉含量和支链淀粉短分支侧链比例显著下降,支链淀粉长分支侧链比例显著升高。上述结果表明,双相淀粉具有较低含量的直链淀粉和较高比例的支链淀粉长分支侧链,其颗粒的外部结构主要由较少的直链淀粉分子和较多的支链淀粉长分支侧链组成。4.玉米sbe2b突变体胚乳双相淀粉形成和胚乳区域性分布的发育原因。本研究以常规玉米Mo17和sbe2b突变体AF11为材料,利用转录组学分析、基因表达水平检测和酶活性测定,分析了双相淀粉的形成和胚乳区域性分布的发育原因。Mo17和AF11的IE.组织经历着比OE组织更为严重的低氧胁迫,其中糖酵解途径相关基因均显著上调表达。淀粉合成相关基因分析显示,与OE相比,SBEIIb在Mo17 IE中下调表达,而在AF11 IE中无明显差异;DEP1在Mo17IE中无明显差异,而在AF11 IE中显著上调表达;SBEIIa在Mo17 IE中无明显差异,而在AF11 IE中15 DAP时显著下调表达,20 DAP时显著上调表达。此外,Mol7IE淀粉的GBSSI活性与OE无明显差异,而AF11IE双相淀粉的GBSSI活性显著低于OE。上述结果表明,逐渐增强的SBEIIb功能缺陷主导了双相淀粉的形成。DPE1表达量的升高和GBSSI活性下降共同降低了双相淀粉外围结构的直链淀粉含量。胚乳内部糖酵解途径的上调减少了用于淀粉合成的碳源,降低了淀粉合成速率,延长了淀粉合成所需时间,从而更容易经历多个从弱到强的SBEIIb缺陷阶段,导致了双相淀粉的胚乳区域性分布。5.抑制SBE的水稻胚乳双相淀粉的结构和发育。本研究以糯性粳稻广陵香糯(GLXN)及其来源的抑制SBEI/IIb表达的转基因水稻株系GLXN-SBEI/IIb-为材料,分析了双相淀粉的结构和发育。在GLXN-SBEI/IIb-胚乳中,SBEI、SBEIIa和SBEIIb的表达量和活性均发生了显著下降,且SBE基因抑制程度随胚乳发育不断加重。GLXN-SBEI/IIb-胚乳中具有典型的双相淀粉,其颗粒外部呈现出梳状凸起的轮廓,并且随着胚乳发育不断加重。在胚乳发育过程中,GLXN淀粉均表现出A-型晶体,支链淀粉的长支链比例、短支链比例和分支度均保持不变;而GLXN-SBEI/IIb-淀粉由A-型逐渐转变为C-型,支链淀粉的长支链比例不断增加,短支链比例不断降低,分支度不断下降。上述结果表明,支链淀粉长分支侧链是组成双相淀粉粒外部梳状结构的主要成分,不断增强的抑制SBE效应是导致双相淀粉粒产生的主要原因。