论文部分内容阅读
猪传染性胸膜肺炎是由猪胸膜肺炎放线杆菌（APP）引起的一种以出血坏死性肺炎和纤维素性胸膜炎为特征的呼吸道传染病，是危害现代养猪业最严重的疾病之一。迄今，APP共有15个血清型。Apx毒素是APP主要的毒力因子和免疫原，15种血清型共产生四种毒素：ApxⅠ、ApxⅡ、ApxⅢ、ApxⅣ。Apx毒素分泌需要操纵子C、A、B、D4种基因的共同作用，A基因是毒素的结构基因。除了血清10型，其余血清型均产生ApxⅡ。以ApxⅡ蛋白为基础建立ELISA方法可作为一种跨越血清型障碍的检测方法，对除10型外所有血清型作出检测。本研究利用基因工程的方法表达ApxⅡA蛋白的主要抗原表位区，并基于此建立检测猪血清中APP抗体的间接ELISA方法，为疾病诊断和疫苗免疫效果评估奠定了基础。主要研究内容如下： 1、猪胸膜肺炎放线杆菌ApxⅡ主要抗原表位区原核表达和优化 将猪胸膜肺炎放线杆菌 ApxⅡ主要抗原表位区基因片段克隆至原核表达载体pET-28a(+)，构建重组质粒pET-ApxⅡA1。将重组质粒pET-ApxⅡA1转化至宿主菌BL21（DE3）中，经IPTG诱导后，外源基因获得高效表达。最佳诱导条件为加入终浓度为1mmol/mL的IPTG37℃诱导5h，融合蛋白主要以包涵体的形式存在于沉淀中。通过Western-blot分析重组蛋白可被兔抗APP阳性血清特异性识别，表明表达产物具有良好的免疫原性。 2、基于ApxⅡ主要抗原表位区的间接ELISA方法建立 将猪胸膜肺炎放线杆菌ApxⅡ主要抗原表位重组蛋白作为包被抗原，包被酶标板，建立了检测猪APP血清抗体的间接ELISA方法。通过反应条件的优化，初步确定了间接ELISA方法的最佳反应条件：其抗原的包被浓度为1.23μg/mL；血清稀释度为1：100；4℃包被过夜；1％BSA37℃封闭1h；一抗反应时间为60min；酶标二抗工作浓度为1：10000；最佳底物显色时间为4min。确定了间接ELISA方法的临界值，对其特异性和重复性进行了检测，并与商品化ApxⅣ抗体检测试剂盒分别对94份临床非免疫血清样品进行检测，两者的符合率为90.4%，表明所建立的间接 ELISA方法具有良好的特异性、重复性。 3、江苏安徽两省部分猪场猪胸膜肺炎放线杆菌流行病学调查 用建立的间接ELISA方法对江苏安徽两省部分猪场2013年采集送检的未免疫猪胸膜肺炎放线杆菌的血清共计552份检测APP抗体，检出230份，总阳性率为41.67%。江苏送检的12个猪场共460份血清，血清总阳性率为40.65%；安徽送检的5个猪场共92份血清，血清总阳性率为46.74%。其中种猪血清总计106份，血清总阳性率为64.15%；南通、徐州两地猪场共送检血清98份，妊娠母猪、育肥猪、保育猪、哺乳猪的血清阳性率分别为100%、25%、14.29%、84.21%。两省的大部分猪场均存在猪胸膜肺炎放线杆菌感染情况，不同生长阶段的猪群均可感染APP。 综上所述，本试验成功原核表达获得猪胸膜肺炎放线杆菌ApxⅡ主要抗原表位区基因片段编码的蛋白，建立了检测猪血清APP抗体的间接ELISA方法，并对江苏安徽两省部分猪场猪胸膜肺炎放线杆菌感染情况进行了调查。