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人乳头瘤病毒16型晚期基因的表达及病毒样颗粒的装配与免疫学分析人乳头瘤病毒(Human Papillomavirus,HPV)是一类双链小分子DNA病毒,具有严格的种属特异性,主要感染人的皮肤和粘膜组织,引起相应部位上皮组织的增生性病变.我们选择杆状病毒—昆虫细胞系统表达从黑龙江地区分离的HPV16L1基因,用于研制基于VLP的宫颈癌预防性疫苗.获得如下实验结果:1.HPV16地区分离株晚期基因的亚克隆、序列分析及目的蛋白表达.将克隆到质粒pCR2.1上的黑龙江地区HPV16分离株L1基因经高保真PCR扩增后,亚克隆到质粒载体pUCm-easy,经测序与原型序列比较,在L1ORF中共有7个核苷酸变异,其中错义突变4个.将HPV16L1和L2基因亚克隆到表达载体pET3a,经SDS-PAGE电泳和western blot检测表明,构建了正确表达HPV16L1和L2基因的原核表达质粒pET3a-16L1/L2.2.HPV16L1和L2基因重组杆状病毒的构建.将HPV16L1基因单独或L1+L2基因共同重组到杆状病毒转移载体pAcUW51,获得两个重组杆状病毒转移质粒pAcUW51-HPV16L1和pAcUW51-HPV16L1L2,将重组的转移载体同线性化的杆状病毒共转染昆虫细胞Sf9,分别获得了重组HPV16 L1或L1+L2基因的杆状病毒rBacV16L1和rBacV16L1L2.3.HPV16L1和L2蛋白在昆虫细胞中的表达及VLP的装配.将获得的重组杆状病毒感染Sf9昆虫细胞并使目的蛋白L1和L2在昆虫细胞中表达,SDS-PAGE电泳和Western blot结果显示:L1和L2蛋白在重组杆状病毒感染的Sf9细胞内均获得表达,其表观分子量分别为57kd和90kd.4.重组HPV16L1 VLP的免疫性分析.用已知抗体对纯化VLP的免疫反应性进行鉴定,HPVL1-VLP可与HPV16 L1单克隆抗体CAMVIR-1反应,具有HPV16特有的抗原表位.综上结论,实验成功构建了两株重组杆状病毒rBacV16L1和rBacV16L1L2,在昆虫细胞中获得了L1和L2蛋白的表达,并在体外经超离获得了L1装配成的VLP,用VLP免疫动物获得了细胞及体液免疫效果.