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[目的]①研究全脑缺血再灌注大鼠模型海马神经元凋亡的变化规律,探讨缺氧诱导因子la (HIF-la)在全脑缺血缺氧再灌注过程中的作用。②探讨严重缺氧引起的HIF-la和p53过度表达是否激活促凋亡通路caspase-9和caspase-3,能够引起细胞凋亡这样的有害结果。③我们想通过实验检验高压氧治疗(HBO)是否是由于提高了大脑的供氧水平而产生了神经保护作用,或能够证明HBO的治疗作用是由于对HIF-la和其下游凋亡基因表达的抑制而起作用。[材料和方法]材料：78只成年SD大鼠(370g)被随机分成13个组(每组数量n=6)：1个假手术组,6个全脑缺血再灌注组(GI),分别为6h,12h,24h,48h,96h和7天组,6个全脑缺血再灌注+HBO治疗组(GI+HBO),分别为6h,12h,24h,48h,96h和7天组。二血管闭塞全脑缺血模型(2VO)：该模型是由Smithl984年发明的,Sugawara做了些改进,我们有所完善。暴露大鼠颈部结构并股动脉抽血时血压保持在30-35 mmHg,随后,大鼠两边的颈总动脉被两个血管夹夹闭10分钟。10分钟后,抽出的血被注射回股动脉中,血管夹被松开。高压氧治疗(3个标准大气压持续两小时)在缺血-低血压1小时后开始.各组实验大鼠分别在6h,12h,24h,48h,96h和7天被断头取脑。Nissl染色和细胞计数：每只动物的海马CA1区在奥林巴斯叠加成像系统中定位扑捉以进行细胞数量的计算。每个区域中被计算出的Nissl染色细胞数量,CA1区细胞的密度被平均,以获得每只动物的平均值。免疫组化染色：将提供在大脑切片上海马CA1区HIF-lal阳性细胞和其它凋亡基因的分布信息。荧光双染标记：假如在相同神经元中HIF-la与其它凋亡基因均呈阳性的话,提供了唯一的信息,即可认定HIF-la和其它凋亡基因呈阳性细胞类型。TUNEL染色：提供DNA破碎的信息,这是凋亡的独特现象。蛋白质印迹分析：将提供HIF-la和其他凋亡基因在神经组织定量变化的信息。每组取4只大鼠脑的样本用于免疫印迹染色的研究。大鼠在相应的时间点断头取脑用于蛋白质印迹分析。[统计分析]本研究的所有资料均由均数的F标准差来表示(SD)。下列一一比较的资料的标准差使用单因素方差分析(ANOVA)。假如发现有显著性差异,则用Tukey-Kramer多重比较法(the Tukey-Kramer multiple comparison procedure.) P< 0.05被认为有显著性差异。[结果]Nissl染色：全脑缺血后24小时时间点,神经组织在海马区有脱失,而在缺氧的皮层神经元脱失成都较轻,在48小时时间点神经元脱失进一步加重,在7天时达到最大值。在所有时间点中,HBO治疗均减轻了脑组织神经元的脱失。全脑缺血-低血压后48小时-7天,海马CA1区的细胞数量明显少于正常对照组(P<0.05, ANOVA)。HBO治疗后48小时-7天海马CA1区的细胞数量与正常对照组有明显差异(P<0.05, ANOVA)TUNEL:全脑缺血-低血压损伤后12小时,较强的TUNEL阳性物质开始出现在海马中,而在皮层中TUNEL阳性物质相对较少。高倍镜显示TUNEL染色发生于神经核内。大脑样本中更强一些的TUNEL染色发生于全脑缺血后24-48小时。全脑缺血经HBO治疗后的样本中很少发现TUNEL细胞(尤其在12-24小时),无论在海马或者皮层中均如此。免疫荧光染色显示,全脑缺血-低血压损伤后24小时,样本海马CA1有HIF-1α阳性细胞(细胞核中的红色)。在同一玻片上进行免疫荧光双染,在神经元细胞核内(绿色),TUNEL呈现阳性染色。将两个复合体融合在一起,证明了海马神经元细胞核中TUNEL与HIF-1α的定位(黄色),这也提示了HIF-1α在凋亡细胞中表达。免疫荧光图片显示,HIF-1α仅出现于神经元的细胞核内而不在细胞浆内。p53, caspase-9和caspase-3的免疫组化表达：在正常对照组的海马和皮层中我们观察到p53, caspase-9和caspase-3免疫组化染色的阴性结果。在全脑缺血-低血压损伤后24小时,可以观察到在海马及皮层p53, caspase-9和caspase-3免疫组化染色强阳性结果。高倍镜下观测样本玻片显示在海马和皮层p53, caspase-9和caspase-3免疫组化染色阳性的神经元。在全脑缺血-低血压损伤后24小时,可以观察到在海马CA1区的神经元免疫荧光双染显示p53(绿)和HIF-1α(红)在神经元核内阳性染色。另外,caspase-9(绿)和caspase-3(绿)在细胞质内的染色呈阳性,HIF-1α(红)阳性染色在细胞核内成阳性染色。Caspase-8和bcl-2的免疫印迹染色表达：关于caspase-8和bcl-2我们获得了意象之外的结果.全脑缺血-低血压损伤后6小时,在缺血的大脑皮层,caspase-8的蛋白表达与正常对照组比较明显升高,在12小时达到高峰,24小时-7天持续维持在一个较高的水平(P< 0.05, GI vs. control, ANOVA)。HBO治疗未能改变caspase-8的蛋白表达的峰值,但却极可能亦不加强了caspase-8 12小时至7天的表达水平(P<0.05, GI+HBO vs. GI)。更有意思的是全脑缺血-低血压损伤后6小时bcl-2的蛋白表达显著升高,然后不断升高在7天时达到高峰(P<0.05, GI vs. control, ANOVA). HBO治疗在所有时间点均显著地降低了bcl-2的蛋白表达(P<0.05, GI+HBO vs. GI).与正常对照组比较,除了24小时(P<0.05 vs. control)以外HBO治疗均降低了bcl-2的蛋白表达水平(P>0.05 vs. control)。[小结]全脑缺血-低血压(10分钟全脑缺血,同时血压保持在30-35mmHg)导致大鼠海马和大脑皮层HIF-la的表达在6小时明显升高,48-96小时达到高峰。p53, caspase-9和caspase-3的表达在相同的时间点均明显升高。这些分子生物学的变化同时伴有海马区神经细胞的大量脱失,大脑皮层的神经细胞也有程度略小一点的脱失,这种细胞脱失有明显的细胞凋亡的特征。HBO能明显减少HIF-la, p53, caspase-9和caspase-3的表达,减少神经细胞的死亡。促凋亡基因caspase-8和抗凋亡基因bcl-2的蛋白水平在全脑缺血后均升高。HBO增加了caspase-8的表达,减少了bcl-2的表达。研究结果显示：尽管全脑缺氧后进行HBO整体上是降低HIF-la的表达,减少神经细胞的凋亡,但是HBO对凋亡基因具有多重作用。[目的]缺氧诱导因子1α(HIF-1α)是一个的由缺氧特异性激活的转录因子。促凋亡通路capase-3可被HIF-1α及p53激活,能够引起像细胞凋亡这样的有害作用。而survivin作为抗凋亡基因能够直接抑制capase-3的表达而减轻细胞的凋亡[1]。进一步的研究提示,survivin是caspase-3, caspase-7的抑制剂[3]。同时有试验证明HIF-1α有抑制survivin表达的作用[2,3]；也有试验表明HIF-1α有上调survivin表达的作用[4]。2ME2是否通过HIF-1α抑制剂,我们想通过实验检验2ME2是否通过抑制HIF-1α的表达而增强或减弱了survivin的表达,是否起到脑保护作用或脑损害作用。[材料和方法]雄性SD大鼠(n=78)被随机地分成13个组(n=6,每组)：1个假手术组,6个全脑缺血再灌注(GI),6个全脑缺血再灌注加2ME2治疗组(GI+2ME2)。全脑缺血10分钟取下动脉夹后,立即给予2-甲氧基雌二醇腹腔注射(16mg/kg体重),大鼠分别在6h,12h,24h,48h,96h和7天时被断头取脑。统计方法：本研究的所有资料均由均数的F标准差来表示(SD)。下列一一比较的资料的标准差使用单因素方差分析(ANOVA)。假如发现有显著性差异,则用Tukey-Kramer多重比较法(the Tukey-Kramer multiple comparison procedure.) P< 0.05被认为有显著性差异。数据用SPSS11.5软件包做统计分析。[结果]全脑缺血10分钟导致大鼠海马HIF-1α和P53的表达在6小时明显升高,48-96小时达到高峰。survivin的表达在相同的时间点均略有升高,而caspase-3的表达明显升高。这些分子生物学的变化同时伴有海马区神经细胞的大量脱失,这种细胞脱失有明显的细胞凋亡的特征。2ME2能明显减少HIF-1α表达[5],使survivin受到的抑制减弱而表达明显增加,从而减少了caspase-3的表达。[结论]研究结果显示：全脑缺氧后给予2ME2治疗,整体上是2ME2抑制HIF-1α的过度表达,HIF-1α对survivin的抑制作用减弱,继而上调了survivin的表达,survivin抑制了caspase-3的表达从而减少神经细胞的凋亡[2]。[目的]①研究全脑缺血再灌注大鼠模型海马神经元凋亡的变化规律,探讨组织型转谷氨酰胺酶(tTG),被tTG抑制的核磷蛋白(NPM),及相关的p53和caspase-3在海马缺血再灌注后的相互作用关系。②缺血再灌注后,应用组胺(cystamine, CYS)作为tTG干预抑制剂,其对于tTG下游相关基因NPM、P53和caspase-3的影响。③通过对tTG的抑制剂cystamine与tTG及其相关基因核磷蛋白和p53和caspase-3相互作用关系的研究,探讨cystamine的保护海马神经元的作用机制。[材料和方法]采用4血管阻断法制作大鼠全脑缺血模型,脑电图验证成功与否。104只SD大鼠随机分为、假手术组(Sham)、全脑缺血组(GI)、全脑缺血+cystamine治疗组(GI+CYS)3组,其中Sham组8只,GI组、GI+CYS组各48只大鼠。GI组和GI+CYS组,按照再灌注后6小时、12小时、1天、3天、5天和7天随机分各为6个亚组,每个亚组8只大鼠。其中GI+CYS组于双侧颈总动脉夹闭10分钟后立即给予cystamine (150mg/kg)腹腔注射,缺血时间在24小时内的只在缺血后给予一次cystamine (150mg/kg)腹腔注射,超过1天的在相应时间点各给予cystamine150mg/kg。Sham组仅暴露两侧椎动脉及颈总动脉,不予电凝及夹闭,每天给予生理盐水lml腹腔注射,于第3天处死。将GI组和GI+CYS组大鼠分别在相应时间点,经灌流固定后取脑。TUNEL染色检测再灌注后不同时间点海马CA1区的神经元凋亡水平。用原位凋亡专用试剂盒处理后,利用显微镜及图像处理系统软件计数海马CA1区TUNEL阳性细胞数。免疫组织化学方法检测缺血再灌注后不同时间点海马CA1区tTG、NPM、p53、和caspase-3表达水平的变化,利用显微镜及图像处理系统软件计数海马CA1区免疫组化阳性细胞数。蛋白质印迹分析方法检测缺血再灌注后不同时间点亚组和CYS治疗组各个时间点亚组海马tTG、NPM、p53、和caspase-3表达水平,用BioRadio半定量方法测定各因子表达情况。统计方法：本研究的所有资料均由均数的F标准差来表示(SD)。下列一一比较的资料的标准差使用单因素方差分析(ANOVA).假如发现有显著性差异,则用Tukey-Kramer多重比较法(the Tukey-Kramer multiple comparison procedure.)P<0.05被认为有显著性差异。数据用SPSS11.5软件包做统计分析。[结果]TUNEL染色：GI组海马CA1区’TUNEL阳性细胞明显增加,1天、3天、5天、7天亚组与Sham组相比有统计学差异(p<0.05)；GI+CYS组再灌注24小时后TUNEL阳性细胞有少量增加,在相应的1天、3天、5天、7天的时间点亚组,GI+CYS组的TUNEL细胞数目比GI组的明显少,具有统计学意义(p<0.05)。免疫组织化学：1.tTG, NPM和p53的表达：Sham组海马CA1区有一定数量的tTG和p53的表达；GI组与Sham组比较其12小时、1天、3天亚组的tTG和p53的表达)均明显升高,具有统计学意义(P<0.01)；GI+CYS组的tTG和p53的表达明显减弱,再灌注7天仍维持在较低水平；与GI组相比,1天、3天、5天、7天亚组tTG和p53的表达显著降低,具有统计学意义(P<0.01),12小时亚组tTG和p53的表达水平略高于GI组,计算无统计学意义(P>0.01)的表达。NPM的表达：Sham组海马CA1区有一定数量的NPM表达。GI组与Sham组比较其12小时、1天、3天亚组的NPM的表达均明显降低,具有统计学意义(P<0.01)；GI+CYS组的NPM表达明显增强,再灌注7天仍维持在较高水平；与GI组相比,1天、3天、5天、7天亚组NPM的表达显著增加,具有统计学意义(P<0.01)。2.caspase-3的表达：caspase-3蛋白在假手术组大鼠海马CA1区中极少见阳性表达；GI组caspase-3蛋白的表达于再灌注6小时可见增加,3天达高峰,7天降至接近正常水平；GI+CYS组caspase-3表达与GI组相比明显减低,但仍高于假手术组,表达变化趋势同GI组,GI+CYS组中1天、3天、5天和7天亚组与GI组相应时间点亚组相比有显著性差异(P<0.05)。蛋白质印迹分析：缺血组tTG蛋白表达在全脑缺血再灌注后6h和12h表达较弱,于全脑缺血再灌注后1d开始升高,于全脑缺血再灌注3d、5d、7d亚组显著高,与假手术组相比,3d、5d、7d时间点亚组蛋白表达升高的差异有显著性意义(P<O.05)；CYS治疗组海马tTG蛋白水平于缺血再灌注后1d开始升高,于3d、5d、7d时间点亚组亦逐渐减弱,但相应各个时间点均显著低于缺血组(p<0.05)；全脑缺血再灌注后,海马神经元NPM蛋白表达水平6小时的表达较正常对照组明显减弱,12小时NPM表达明显恢复,1天时间点恢复至与正常对照组水平,然后在3天、5天和7天保持较高的水平。CYS治疗后NPM蛋白表达水平从6小时开始升高,1 d时达到高峰,3d,5d,7d均保持较高的表达水平,CYS治疗后,治疗组各个时间点NPM的蛋白表达水平均明显高于缺血组,比较有显著差异(p<0.05)；全脑缺血再灌注后,海马神经元p53蛋白表达水平从6小时开始积聚升高,到7天时接近正常水平；CYS治疗后,治疗组各个时间点p53蛋白表达水平6 h,12h和1d时间点明显低于缺血组,比较有显著差异(p<0.05)。缺血组caspase-3蛋白表达于缺血再灌注6h即明显升高,从3的开始下降,单直至7d仍处于较高水平(P<0.05)；治疗组caspase-3蛋白水平于再灌注后6h,12h,1d、3d、5d、7d各亚组较缺血组均明显减低,相应时间点的比较有显著性差异(p<0.05)。[结论]全脑缺血再灌注损伤可以诱导核磷蛋白(NPM)表达的下调,同时导致组织型转谷氨酰胺酶(tTG)、p53和caspase-3表达上调,从而导致海马神经元的损伤,最终神经元凋亡,我们认为神经元的凋亡是与tTG, NPM, p53和caspase-3这个细胞信号传递系统有重要相关的。CYS能够抑制tTG的表达,而tTG的表达抑制导致了下游通常被抑制状态的核磷蛋白的过度表达,核磷蛋白的过度表达减少了p53在线粒体内的水平；同时核磷蛋白还直接(或间接)抑制了caspase-3的表达,这个过程可能是全脑缺血再灌注损伤后CYS保护海马神经元免于凋亡的作用机制。